Band 20, Heft 4

Zusammenfassung In den vergangenen Jahren hat sich die Anwendung der Mikroarraytechnologie für die Detektion von putativ pathologischen submikroskopischen Copy-Number-Variationen (CNV) einen festen Platz in der molekularen Zytogenetik erobert. Neben der Identifikation somatischer CNV in der onkologischen Diagnostik wird diese Technologie nunmehr für die Analyse von konstitutionellen CNV bei Patienten mit mentaler Retardierung genutzt. Arraybasierte genomische Hybridisierungen zeigen eine deutliche Verbesserung zu der bereits seit Jahren angewendeten komparativen genomischen Hybridisierung (CGH). Insbesondere weisen die dazugehörigen Technologien eine verbesserte Auflösung von weniger als 100 kb für Deletionen und Duplikationen auf und haben damit eine deutlich bessere Aufklärungsrate von Krankheiten mit Behinderungen ungeklärter Ursache. In einigen Zentren gehört die Arraytechnologie daher bereits zur Routinetechnologie der Syndromabklärung. Im vorliegenden Beitrag soll deshalb auch auf die Gemeinsamkeiten bzw. Unterschiede der verschiedenen Basistechnologien der Arraytechnik eingegangen werden.

Zusammenfassung Der Themenschwerpunkt dieser Ausgabe der Zeitschrift „Medizinische Genetik“ ist der gegenwärtigen Entwicklung der Zytogenetik gewidmet. Die klassische Bänderungsanalyse, die seit Jahrzehnten in der humangenetischen Routinediagnostik eine zentrale Position einnimmt, wird anhand qualitätssichernder Maßnahmen dargestellt. Verschiedene Beiträge beschreiben die molekulare Zytogenetik, die im Wesentlichen auf der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) beruht. Die Einführung der vergleichenden genomischen Hybridisierung [“comparative genomic hybridization“ (CGH)], speziell auf Arrayplattformen, hat die Zytogenetik revolutioniert und erlaubt die Bearbeitung völlig neuer Fragestellungen. Ein besonderer Schwerpunkt der Zytogenetik, der sie von vielen anderen molekularen Techniken unterscheidet, ist, dass sie Analysen auf Einzelzellniveau ermöglichen. Mit dem vorliegenden Heft wird auch versucht, mögliche zukünftige Entwicklungen der Zytogenetik aufzuzeichnen.

Zusammenfassung Die humangenetische Diagnostik umfasst eine Vielzahl von Verfahren, die sich aufgrund ihrer spezifischen Einsatzbedingungen und Anwendungsmöglichkeiten gegenseitig ergänzen. Mit der stetigen Entwicklung neuer Methoden ist es sinnvoll und notwendig, etablierte Techniken auf den Prüfstand zu stellen. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Standardmethode in der genetischen Diagnostik und Forschung. Abhängig vom Design der Sonden ist es möglich, ganz individuell DNA-Abschnitte oder auch das gesamte Genom im Fluoreszenzmikroskop in Metaphasechromosomen, in Interphasezellkernen, in Gewebeschnitten oder in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Besonders häufig wird die FISH-Technik in der humangenetischen Diagnostik für die Darstellung und Analyse von Mikrodeletionen, Translokationen, Inversionen und Insertionen, also von Strukturaberrationen der Chromosomen, sowie für die Charakterisierung von Markerchromosomen, zur Kartierung von Chromosomenbruchpunkten und zum Aneuploidiescreening im „pränatalen FISH-Schnelltest“ eingesetzt. Die Stärke der Methode liegt dabei in der Untersuchung einzelner Zellen, sodass auch genetisch heterogene Zellpopulationen (Mosaike) im untersuchten Gewebe mit hoher Sicherheit festgestellt oder ausgeschlossen werden können. Außerdem ist es möglich, die morphologischen und immunologischen Eigenschaften der Zellen bei der Auswertung zu berücksichtigen, sodass genetische Veränderungen bestimmten Zellarten zugeordnet werden können.

Zusammenfassung Sämtliche hämatologische Neoplasien zeigen eine große klinische Variabilität. Allerdings lassen sich die Entitäten in eine Vielzahl von Prognose bestimmenden Subtypen auf der Basis genetischer Marker einteilen. Die individuelle Abstimmung der Therapie erfordert daher eine exakte Klassifikation des genetischen Subtyps. In Verbindung mit der Chromosomenanalyse spielt die Fluoreszenz- in-situ -Hybridisierung (FISH) dabei eine zentrale Rolle – für die weitere Aufklärung von Befunden der Chromosomenanalyse, z. B. bei akuten Leukämien, oder die Klassifikation diverser Subtypen, wie bei den Non-Hodgkin-Lymphomen. In Abhängigkeit von der Erkrankung kommt der FlSH-Analyse eine unterschiedliche Bedeutung zu. Sie wird zum einen als Methode der ersten Wahl zur genetischen Charakterisierung einer Erkrankung, z. B. des multiplen Myeloms, angewandt, oder kommt in Kombination mit der Chromosomenbänderungsanalyse zum Einsatz. Ferner kommt ihr eine essenzielle Bedeutung zu, wenn eine rasche Bestätigung einer Diagnose erforderlich ist, wie bei der akuten Promyelozytenleukämie mit t(15;17)/ PML - RARA -Rearrangement, bei der ein sofortiger Therapiebeginn mit All-trans-Retinsäure (ATRA) notwendig ist.

Zusammenfassung Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an dreidimensional konservierten Zellkernen (3D-FISH) ist eine effiziente Methode für Untersuchungen zur 3D-Anordnung von Chromatin im Zellkern. Die Zellkernarchitektur stellt eine Ebene epigenetischer Mechanismen der Genregulation dar. 3D-FISH-Untersuchungen belegten eine große Variabilität in den Nachbarschaftsbeziehungen individueller Chromosomenterritorien im Zellkern. Im Gegensatz hierzu konnte eine distinkte radiale, von der Gendichte abhängige Anordnung von Chromatin gezeigt werden, die evolutionär hochkonserviert ist. Genreiches Material ist bevorzugt in der Kernmitte, genarmes in der Kernperipherie angeordnet. Die Frage einer räumlichen Assoziation kotranskriptionell exprimierter Gene (so genannte „expression hubs”) wird derzeit kontrovers diskutiert.

Zusammenfassung Die molekulare Zytogenetik ist ein wesentliches Instrument der Diagnostik und Forschung an menschlichen Chromosomen. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist hierbei die maßgebliche Technik. Seit Mitte der 1990er Jahre wurde eine Vielzahl verschiedener Vielfarben-FISH-Sondensets für unterschiedliche Fragestellungen etabliert und verfügbar gemacht. Im vorliegenden Beitrag wird diese Entwicklung aufgezeigt und dargestellt. Die der Vielfarben-FISH zugrunde liegenden Prinzipien, deren vielfältigen Spielarten und Anwendungen werden zusammengefasst. Schließlich wird eine Prognose bezüglich der Bedeutung der molekularen Zytogenetik im künftigen Zusammenspiel mit den Chiptechnologien getroffen.

Zusammenfassung Das erste regionale Projekt für eine externe Qualitätssicherung (EQA) in der klinischen Zytogenetik entstand in Deutschland im Jahr 1989. 1993 erfolgte eine überregionale Ausweitung des Programms. Gegenwärtig nehmen 92 Laboratorien aus Deutschland, 11 aus der Schweiz und 5 aus Österreich an den Ringversuchen zur Qualitätssicherung teil. Basierend auf dem Quality Assessment Scheme der Association of Clinical Cytogeneticists (1988) aus Großbritannien wurden in der ersten Periode der Ringversuche die Qualität der Chromosomenpräparation und die Schnelligkeit in der Routinediagnostik sowohl in der Prä- (nach Amniozentese) als auch in der Postnataldiagnostik (Lymphozyten) evaluiert. Als ein Ergebnis dieser kontinuierlichen EQA stieg die durchschnittliche Bandenauflösung von unter 400 bphs 1994 auf ungefähr 450 bphs in der pränatalen Zytogenetik und von ungefähr 400 bphs auf über 500 bphs in der postnatalen Diagnostik. 1999 wurde das EQA-Verfahren durch Ringversuche zur Diagnostik, Interpretation und Dokumentation von Strukturaberrationen ausgeweitet (RV-“Strukturanalyse“). Eine numerische Bewertung für die Erkennung, die Interpretation sowie die Befundmitteilung von zugesandten Karyotypen, für die aktuelle Fälle aus teilnehmenden Laboratorien genutzt wurden, erlaubt den Teilnehmern eine Abschätzung ihrer Fähigkeit, bei vorgegebener Präparatequalität strukturelle Aberrationen, häufige Fehler bei der Karyotypisierung und Fehler bei der Dokumentation der Karyotypformel entsprechend der ISCN-Nomenklatur zu erkennen. Die kontinuierliche Teilnahme an Ringversuchen zur EQA in der Zytogenetik, an der sich die Mitglieder der teilnehmenden Laboratorien aktiv beteiligen können, führt zu einer Anhebung der Qualität in der Chromosomenpräparation sowie gleichzeitig einer Verbesserung in der Diagnostik durch Vermeidung typischer häufiger Fehler in der Karyotypisierung und fehlerhafter Benutzung der ISCN-Nomenklatur.

Zusammenfassung Molekulare Karyotypisierung bezeichnet die genomweite Analyse bezüglich genetischer Kopienzahlveränderungen mit Hilfe von Arrays, welche das Genom mehr oder weniger dicht mit molekularen Markern abdecken. Die Hauptanwendung in der klinischen Diagnostik liegt derzeit bei der Analyse von Patienten mit geistiger Behinderung und multiplen Anomalien unbekannter Ursache. Bei ihnen lassen sich nach Ausschluss von konventionell-zytogenetisch sichtbaren Aberrationen, kryptischen subtelomerischen Aberrationen und klinisch gut erkennbaren, häufigen Mikrodeletionssyndromen in rund 10% der Fälle mittels molekularer Karyotypisierung chromosomale Mikroaberrationen nachweisen. Hierdurch konnten in den letzten Jahren zahlreiche neue Mikrodeletions- und -duplikationssyndrome charakterisiert werden, jedoch wurde auch ersichtlich, dass die Interpretation von Einzelbefunden aufgrund der großen Anzahl an genomischen Kopienzahlpolymorphismen nicht trivial ist.

Zusammenfassung Durch Array-CGH („comparative genomic hybridization“) können genomweit Kopienzahlveränderungen mit hoher Auflösung erfasst werden. In der letzten Dekade zeigte sich, dass diese in Tumorgenomen häufig und in größerer Anzahl vorliegen können. Über Abweichungen im Array-CGH-Profil einer Tumor-DNA können Tumorsuppressor- oder Protoonkogene kartiert werden, sodass krebsrelevante Gene identifiziert werden konnten. Weiterhin werden Aberrationsmuster erfasst, was zur molekularen Subklassifikation von Tumortypen mit diagnostischer Bedeutung führte. Auch zur Identifizierung neuer prognostischer Marker konnten Array-CGH-Analysen beitragen. In Zukunft werden eine Datenbewertung durch Einbeziehung von Analysen auf anderen molekularen Ebenen und eine gezielte Anwendung mit chromosomen- oder tumorspezifischen Mikroarrays wichtig sein.

Zusammenfassung Unter strukturellen Genomvarianten (SV) versteht man chromosomale Veränderungen größer als 1 kb. Obwohl es dank des technischen Fortschritts immer besser gelingt, die qualitativen und quantitativen Eigenschaften von SV zu definieren, sind deren phänotypischen Konsequenzen meist nur unzureichend verstanden. Die Unterscheidung zwischen neutraler Variante, prädisponierendem Faktor und krankheitsverursachender Veränderung stellt heute eine der großen Herausforderungen in der humangenetischen Diagnostik dar.

Zusammenfassung Die traditionelle Zytogenetik ist ein Paradebeispiel für eine Einzelzelldiagnostik, weil mit jeder gebänderten Metaphase das gesamte Genom einer Zelle – bei relativ niedriger Auflösung – untersucht wird. Dies repräsentierte über mehrere Jahrzehnte einen wichtigen Unterschied zu molekulargenetischen Untersuchungstechniken, die in der Mehrheit der Fälle auf DNA oder RNA basieren, die aus hunderten oder tausenden von Zellen extrahiert wurden. Viele Fragestellungen können jedoch nur durch Analysen auf dem Niveau einzelner oder weniger Zellen beantwortet werden. Deshalb wurden besonders in den letzten Jahren neue Einzelzelltechniken mit dem Ziel entwickelt, immer mehr Loci mit verbessertem Auflösungsvermögen simultan analysieren zu können. In dieser Übersichtsarbeit werden die diesbezüglich wichtigsten Entwicklungen der letzten Jahre zusammengefasst.