Drug-Delivery-Systeme

P18

TRANSDERMAL DRUG DELIVERY USING CHITOSAN NANOPARTCLES

*R. Wyrwa¹, S. Möller¹, K. Döhler², A. Heppe², M. Schnabelrauch¹

¹INNOVENT e.V., Biomaterialien, Jena, Deutschland

²BioLog Heppe GmbH, Landsberg, Deutschland

Introduction:

Many drug substances exhibit low bioavailability after oral administration due to fast metabolisation especially by the so-called “first-pass-effect” within the liver. Therefore, different strategies of drug administration have been developed to circumvent the metabolic effects in the liver as well as the intestinal wall. To increase bioavailability often intravenous, subcutaneous, buccal or transdermal applications are used exhibiting different advantages. While intravenous and buccal drug administration lead to fast systemic distribution with high initial drug levels a subcutaneous and transdermal drug delivery show in most cases an additional depot effect leading to long-lasting constant serum levels. Thereby a transdermal administration is preferred avoiding undesired injections. But to reach a sufficient transdermal drug delivery the skin barrier has to be circumvent. Thus a number of substances and techniques were developed to improve the skin permeability within the last decades.

It could be shown that chitosan nanoparticles have a high potential to develop transdermal drug delivery systems (DDS). It was proofed that chitosan nanoparticles can be applied as transdermal DDS for the natural steroidal hormone estradiol. Normally estradiol exhibits a very low bioavailability of below 10 % after oral administration in human.

Materials and Methods:

Chitosan nanoparticles were produced according to a method described earlier [1]. Chitosan solutions of different viscosities mixed with defined amounts of estradiol were evaporated by ultrasonic spray dispersion. The resulting nanoparticles were electrostatically collected after drying at ambient temperature. Under defined conditions chitosan nanoparticles could be prepared and loaded with different amounts of estradiol. The particles were characterized by SEM investigation showing spheres with diameters ranging between 100 nm and 1 μm with a mean particle size of 700 nm.

For investigation of the estradiol content in the nanoparticles HPLC analysis was used. The concentration of estradiol was determined after dissolution of the chitosan particles in aqueous acetic acid.

Chitosan nanoparticles could be loaded with sufficient amounts of the biologically highly active estradiol of up to 0.1 % (w/w).

For transdermal administration skin of the back of Wistar rats was shaved of a size of about 3 cm² two days before the study to ensure intact skin. The skin of the narcotized animals was treated for one hour with the nanoparticle powder. Before awakening from anesthesia the skin was cleaned carefully from remaining particles.

Results and Discussion:

To investigate the hormonal effect of the estradiol loaded nanoparticles the material was subcutaneously and transdermally administered to Wistar rats after ovariectomy in comparison to a subcutaneous administration of a single dose of 0.3 μg of estradiol evoking estrus after one day. The efficacy was determined by using the Allen-Doisy test. In addition the uterine weights were determined.

A strong depot effect could be found after subcutaneous and transdermal administration of the estradiol loaded chitosan nanoparticles. After single dose administration a long lasting effect was found in the vaginal mucous membrane over 4 days accompanied with strong uterine growth.

To evaluate toxic effects of the new estrogenic material to other target organs also changes of the weights of liver, kidneys and adrenal glands were determined. Compared to the control group no significant differences were observed indicating no negative effect to these organs.

The results emphasize the use of estradiol loaded chitosan nanoparticles as steroidal hormone carrier for transdermal applications. With this estradiol based DDS the estrogenic compound 17a-ethinylestradiol (EE) widely used in contraceptives and hormone replacement therapies can be replaced. Especially EE causes hepatic effects within the liver possibly responsible for undesired side effects during estrogenic hormone therapy.

References:

[1] A. Heppe, S. Chandrkrachang, WO 002003029297, 2003.

P19

Komposite aus mesoporösem, bioaktivem Glas und Calciumphosphatzement als Protein Delivery System

*M. Schumacher¹, L. Reither¹, A. Lode¹, M. Gelinsky¹

¹Technische Universität Dresden, Zentrum für translationale Knochen, Gelenk und Weichgewebeforschung, Dresden, Deutschland

Einleitung:

Calciumphosphat-Knochenzemente (CPC) eignen sich aufgrund ihrer Biokompatibilität und Resorbierbarkeit für die klinische Regeneration knöcherner Defekte. Weiterhin lassen sie sich als delivery system für Proteine bzw. Wachstumsfaktoren nutzen, um therapeutisch wirksame Substanzen lokal in einen Defekt freizusetzen. Wegen der meist ungünstigen Freisetzungskinetik bei einfacher Beimischung von Proteinen in den Zement sowie der Gefahr einer Denaturierung der Proteinstruktur besteht jedoch Bedarf an Carrier-Systemen, welche Proteine während der Zementverarbeitung schützen und eine kontrollierte Freisetzung erlauben.¹ In diesem Zusammenhang stellen mesoporöse, bioaktive Gläser (MBG) ein interessantes System dar; das über einen Sol-Gel-Prozess in Gegenwart eines polymeren Templats hergestellte MBG besitzt eine hochgradig geordnete Porenstruktur im Bereich von 2-50 nm.² Diese Poren wurden im vorliegenden Projekt mit Proteinen beladen um eine kontrollierte Freisetzung aus einem CPC/MBG Komposit zu erreichen.

Materialien und Methoden:

MBG (Si-CaO-P₂O₅: 80-15-5 mol-%) Partikel wurden mit den Modellproteinen BSA (IEP 4,8) und Lysozym (Lyz, IEP 11,8) beladen und in CPC/MBG Komposite auf Basis eines etablierten Calciumphosphatzements (InnoTERE GmbH)³ integriert. Neben Zementeigenschaften wie Abbindeverhalten und mechanischer Festigkeit wurde die Proteinfreisetzung in HEPES-Puffer bei 37°C mittels Bradford-Assay sowie die Enzymaktivität des Lyz mittels eines auf Micrococcus lysodeikticus basierenden Assays untersucht.

Ergebnisse und Diskussion:

Durch die Beimischung von MBG wurden weder Abbindeverhalten noch mechanische Eigenschaften des Komposits gegenüber dem reinen CPC negativ beeinflusst. Für BSA, insbesondere jedoch für das negativ geladene Lyz wurde durch MBG als carrier eine signifikante Verringerung der Freisetzung von ca. 60 auf rund 30% binnen 39 d erreicht (Abb. 1), wobei es lediglich zu einer leichten Abnahme der Enzymaktivität mit der Zeit kam. Das vorgeschlagene CPC/MBG Kompositmaterial eignet sich daher als protein delivery system für Proteine oder Wachstumsfaktoren.

Referenzen:

¹ M.P. Ginebra et al., Adv Drug Deliv Rev, 2012.

² Y. Zhu et al., Micropor Mesopor Mat, 2008.

³ M. Schumacher et al., Acta Biomater, 2013.

Danksagung:

Diese Arbeit wurde von der Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert (SFB/Transregio 79).

Anhang 1

P20

Herstellung und Beladung von bioabbaubaren Polylactid-co-Glycolid (PLGA) Mikropartikeln mit Rifampicin als antimikrobieller Wirkstoff

*J. Reinbold¹, A. Freisinger¹, T. Hierlemann¹, I. Müller², C. Schlensak¹, H. P. Wendel¹, S. Krajewski¹

¹Universitätsklinikum Tübingen, Forschungslabor der Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie, Tübingen, Deutschland

²Hochschule Albstadt-Sigmaringen, Sigmaringen, Deutschland

Einleitung:

In den letzten Jahrzehnten haben bioabbaubare Polymere und vor allem Polylactid-co-Glycolid (PLGA) an Bedeutung in der Medizin und Pharmazie gewonnen. Der Grund hierfür ist die gute Bioabbaubarkeit, Biokompatibilität und die unbedenklichen toxikologischen Eigenschaften. Es handelt sich bei PLGA um eines der wenigen Polymere, welches von der FDA für klinische Anwendungen im Menschen zugelassen ist. Heutzutage wird PLGA sehr häufig in Systemen mit kontrollierter Wirkstofffreisetzung verwendet. Dies beinhaltet Mikropartikel, Nanopartikel wie auch Implantate. PLGA Mikropartikel sind auf dem Markt hauptsächlich als Depots für Arzneimittel verbreitet. Diese können auf der einen Seite Wirkstoffe schützen, diese aber auch kontrolliert über einen längeren Zeitraum abgeben. In PLGA Mikropartikel eingearbeitete Wirkstoffe werden innerhalb weniger Tage bis hin zu mehreren Wochen freigesetzt. Neben der Freisetzungsgeschwindigkeit ist die Einschlusseffizienz der eingesetzten Wirkstoffe von zentraler Bedeutung. Die Mikropartikel können direkt in betroffene Regionen im Körper eingebracht werden und dort lokal die eingearbeiteten Wirkstoffe freisetzen. Hierdurch wird die Effektivität signifikant erhöht. Das Antibiotikum Rifampicin ist, durch seine Eigenschaft die RNA-Synthese von bestimmten Bakterien zu verhindern, für einen solchen Einsatz in Mikropartikeln bestens geeignet, um lokal Infektionen verhindern zu können.

Materialien und Methoden:

Die Herstellung der Mikropartikel erfolgte über das Evaporationsverfahren. Hierbei wurden eine kontinuierliche und eine organische Phase miteinander vermischt, wodurch eine Einfachemulsion (O/W) erzeugt wird. Durch anschließendes evaporieren härten die Emulsionströpfchen zu festen Mikropartikeln aus. Die organische Phase enthält PLGA (Resomer 502H; MW 7000-17000; Evonik Industries AG, Essen). Die Zusammenführung der beiden Phasen erfolgte nach einem bestimmten Prinzip. Zunächst wurde die wässrige Phase in einem bestimmten Verhältnis zur organischen Phase vorgelegt die tropfenweise zugeführt wird. Nach der Herstellung der Emulsionströpfchen wird über einen definierten Zeitraum bei Raumtemperatur evaporiert. Hierbei verdampft das Lösungsmittel aus den Emulsionströpfchen heraus, wodurch diese zu festen Mikropartikeln aushärten. Nach der Herstellung wurden die Mikropartikel auf verschiedene Parameter, wie Partikelgrößenverteilung, Einschlusseffizienz des Rifampicins und Zytotoxizität hin untersucht. Um die Wirkung auf Bakterien in vitro zu untersuchen wurde das Bakterium Staphylococcus aureus herangezogen. Einzelne, beladene Mikropartikel wurden auf mit Staphylococcus aureus ausgestrichene Agarplatten gelegt und für 24 h bei 37°C inkubiert. Um eine Langzeitfreisetzung zeigen zu können wurde dieser Partikel nach einem definierten Zeitintervall auf eine neu bestrichene Agarplatte umgesetzt und erneut inkubiert. Dieser Prozess wurde über einen Zeitraum von 40 Tagen wiederholt.

Ergebnisse und Diskussion:

Die Bestimmung der Einschlusseffizienz ergab, dass 60-75 % des eingesetzten Rifampicins in die Mikropartikel eingearbeitet werden konnte, bei einer Partikelgrößenverteilung zwischen 130 und 180 μm. Weiter zeigte die mikroskopische Auswertung, dass die einzelnen Partikel einheitlich rund und mit einer glatten Oberfläche versehen sind. Weiterhin konnten keine negativen Effekte auf die Zellviabilität festgestellt werden. Die antibakterielle Wirkung der beladenen Mikropartikel auf die mit Staphylococcus aureus bestrichen Agarplatten nach 24 h war eindeutig. Nach dieser Zeit war ein deutlicher Hemmhof rund um den einzelnen Partikel zu erkennen. Ebenfalls war nach der Periode von 40 Tagen noch eine antimikrobielle Wirkung erkennbar. Somit wurde hier erfolgreich ein hoch potentes Antibiotikum in bioabbaubare und gut verträgliche Mikropartikel eingebettet, welches über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden kann. Diese könnten zum Beispiel noch während verschiedener Operationen direkt in betroffenes Gewebe oder auf Implantaten eingebracht werden, um bereits existente Infektion zu bekämpfen oder um operationsbedingte Infektionen zu verhindern.

P21

Radiation protecting effects of antioxidants loaded nanocontainers on tumor and healthy cells

*K. Borrmann¹, B. Greve², U. Haverkamp², B. Pajaziti³, I. A. Kurzina⁴, L. Heinrich^5,4

¹Westfälische >Wilhelms Universität Münster, Institut für Biochemie, CeNTech, Münster, Deutschland

²Universitätsklinikum Münster, Klinik für Strahlentherapie - Radioonkologie, Münster, Deutschland

³Westfälische Wilhelms Universität Münster, Institut für Pharmakologie, Münster, Deutschland

⁴National Research Tomsk State University, Laboratory of transmission cell-like and molecular biomedicine, Tomsk, Deutschland

⁵marcotech oHG, Westfälische Wilhelms Universität Münster, Münster, Deutschland

Introduction:

Radiotherapies using X- and gamma-ray effectuate besides the damage of the tumor tissue also impairments of healthy cells. Direct interaction takes place with bio-macromolecules such as proteins, lipids, DNA and RNA. Typical doses applied in radiotherapy of about 2 Gy kill the cells or mutating the DNA by breaking the double-stranded or the single-stranded chains. Indirect interaction within the cytoplasm and interstitium creates reactive chemical species which in turn interact with critical macromolecules. Free radical hydrogen and hydroxyl molecules (reactive oxygen species = ROS), as well as nitrogen oxide radicals (reactive nitrogen species = RNS) achieve a high cell toxicity. In contrast to the systemic administration of antioxidants, the local antioxidant delivery to the radio-treated tissue promises an improved protecting efficacy, especially against the indirectly radio-generated ROS [1]. Background of the investigations is the development of an antioxidant delivering overlay to protect healthy tissue against irradiation associated damages during intraoperative radiation therapies (IORT).

Materials and Methods:

The antioxidants of vitamin E provide a promising potential scavenging free radicals [2]. Therefore α-tocopherol (TP) and γ-tocotrienol rich fraction (Palm-TRF) were selected as liposome formulations prepared from cholesterol and phosphatidylcholine according the film method. The lipophilic antioxidants are incorporated within the bilayers of the liposomes which act as nanocontainers of about 200 nm (estimated by DLS) in aqueous PBS 7,4. Alternatively, the amphiphilic tocopheryl ethylene glycol 1000 succinate (TPGS) forms in PBS micelles of about 20 nm, if the critical micelle concentration of 0,02 wt% is exceeded.

The toxicity and the radioprotective potential of the proposed antioxidants were studied in-vitro using the human fibroblast cell line HaCat and in the hormone receptor positive breast cancer cell line MCF-7. According to literature, the radio-protective effects of γ-tocotrienol and TPGS to healthy cells such as HaCat cells should be higher than to tumor cells. The nanocontainers loaded with the different antioxidants, were added to the cell cultures. The loaded liposomal nanocontainers access the cells via endocytosis. The cell cultures were irradiated with X-ray (2 Gy) using the electron beam accelerator (VARIAN trueBeam T02). The survival and proliferation of the two cell lines were determined by colony formation assays. Cell culture experiments were done at least three times (each in triplicate). Mean value and standard deviation were calculated. Significance was determined using t-test.

Results and Discussion:

α-tocopherol and the α-tocotrienol containing Palm-TRF have a protective effect for HaCat cells against oxidative stress, with Palm-TRF being more protective than γ-tocopherol. Furthermore Palm-TRF effectuated a higher protection efficacy to HaCat cells than to MCF-7 cells. Surprisingly, the micellar TRGS indicated cell toxic effects, probably caused by the applied concentrations. The results of the comparative investigations will be presented and discussed with respect to the estimated oxygen radical absorbance capacities (ORAC) [3] of the antioxidants incorporated in nanocontainers.

References:

[1] Bolus N.E., Basic Review of Radiation Biology and Terminology, J. Nucl. Med. Techn. 2001, 29 (2): 67-73

[2] Augustyniak A. et al., Natural and synthetic antioxidants: An updated overview, Free Radical Res., 2010; 44(10):1216-1262

[3] Cao, G.; Alessio, H. M.; Cutler, R. G. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radical Biol. Med. (1993)14: 303-311

P22

Ankopplung von Aptameren an redoxsensitive Nanogele für aktives Tumor-targeting

*I. Zilkowski¹, L. Civit², I. Theodorou³, K. Albrecht¹, F. Ducongé³, G. Mayer², J. Groll¹

¹Universitätsklinikum Würzburg, Abteilung für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde , Würzburg, Deutschland

²Universität Bonn, Abteilung für Chemische Biologie und Chemische Genetik, Bonn, Deutschland

³Universität Paris-Sud, Molecular Imaging Research Center, Fontenay-aux-Roses Cedex, Frankreich

Einleitung:

Nanogele bieten durch ihr engmaschiges Netzwerk von wasserlöslichen Polymersträngen eine hydrophile Umgebung und sterischen Schutz für eingebettete biologische Wirkstoffe, können jedoch gleichzeitig an der Partikelperipherie funktionalisiert werden. Zuvor haben wir die Herstellung disulfidverknüpfter poly(glycidol)basierter Nanogele beschrieben, welche spezifisch im Zytosol degradieren [1]. Hier zeigen wir ihre Oberflächenmodifizierung mit tumorzellspezifischen Aptameren.

Materialien und Methoden:

Nanogele wurden wie zuvor in [1] beschrieben hergestellt. Die Funktionalisierung der Nanogele mit Aptameren erfolgte über die Thiol-en Click-Reaktion eines allylfunktionalisierten fluoreszenzmarkierten Aptamers mit freien Thiolgruppen an der Oberfläche der Nanogele direkt nach ihrer oxidativen Vernetzung. Nach Absättigen der verbliebenen Thiole mit 2-Hydroxyethylacrylat wurde die organische Phase entfernt und durch Dialyse eine wässrige Dispersion von Nanogelen erhalten. Die Charakterisierung der Nanogele erfolgte mit Hilfe der Nanotracking Analyse, der Rastersondenmikroskopie, Fluoreszenzspektroskopie und der Agarose-Gel-Elektrophorese. Die Aptamerkopplung wurde mittels qPCR quantifiziert und eine erste Evaluation der Biodistribution wurde in einem murinen humanen Prostatatumormodel durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion:

Nanogel-Aptamer-Konstrukte konnten erfolgreich in einem Größenbereich zwischen 100 und 400 nm hergestellt werden. Die Ankopplung wurde qualitativ durch die Agarosegelelektrophorese und quantitativ durch qPCR bestätigt. Atto488 markierte Aptamere konnten durch Fluoreszenzspektroskopie in der Nanogeldispersion nachgewiesen werden. Erste in vivo Experimente zeigten schon eine gute Bioverträglichkeit und passive Tumorakkumulation der nicht funktionalisierten fluoreszenzmarkierten Nanogele.

Durch die Erweiterung der Standardnanogelsynthese [1] haben wir somit redoxsensitive Nanogele erhalten, die zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Aptameren verknüpft sind. Die biologisch funktionalisierten Nanogele werden in weiteren in vivo und in vitro Studien auf ihre veränderte Biodistribution hin untersucht werden.

Referenzen:

[1] S. Singh, I. Zilkowski, A. Ewald, T. Maurell-Lopez, K. Albrecht, M. Moeller, J. Groll, Macromolecular Bioscience 2013, 13, 470.

P23

Die Transfizierbarkeit unterschiedlicher Zelltypen mit Nanopartikeln

*B. Neuhaus¹, O. Rotan¹, B. Tosun¹, M. Epple¹

¹Universität Duisburg-Essen, Institut für Anorganische Chemie, Essen, Deutschland

Einleitung:

Das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen ist sowohl für therapeutische Zwecke (Gentherapie) als auch für die Grundlagenforschung interessant. Wegen ihrer negativen Ladung und hydrophilen Eigenschaften ist es schwierig, Nukleinsäuren über die Zellmembran zu transportieren. Neben viralen Transfektionssystemen sind anorganische Nanopartikel als Transporter von besonderem Interesse. Durch ihre hohe Biokompatibilität und einfache Synthese sind Calciumphosphat-Nanopartikel ein attraktives Trägersystem. Die Beschichtung mit Polyethylenimin (PEI) führt zu einer positiven Partikelladung und einer verbesserten Transfektionseffizienz.^[1] Verschiedene Zelltypen lassen sich dabei unterschiedlich gut transfizieren.^[2] Um einen Einblick über den Zusammenhang zwischen Zelltyp und Transfektionseffizienz zu gewinnen, wurden in dieser Studie elf verschiedene Zelllinien mit den gleichen Nanopartikeln sowie mit Lipofectamin^® transfiziert.

Materialien und Methoden:

Es wurden mehrschalige Calciumphosphat-Nanopartikel synthetisiert und mit pcDNA3-eGFP beladen. Durch eine Beschichtung der Partikel mit PEI (Polyethylenimin) wurde eine positive Partikelladung erzeugt. Die DNA war dabei im Innern der Nanopartikel vor dem Abbau durch Nukleasen geschützt.

Verschiedene humane und murine Zelllinien (4T1, THP-1, U937, MC3T3, Mode-K, CV-1, HeLa, MG-63, A549, Huh7) sowie eine Primärkultur von hMSCs wurden unter konstanten Bedingungen mit Nanopartikeln inkubiert. Die Transfektionseffizienz wurde für jede Zelllinie mit Lipofectamin^® 2000 Reagent verglichen. Die Expression von enhanced green fluorescent protein (eGFP) wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Vitalität der Zellen konnte über MTT-Tests ermittelt werden. Zusätzlich wurde die Aufnahme der Partikel durch die verschiedenen Zelllinien mit fluoreszierenden Nanopartikeln untersucht.

Ergebnisse und Diskussion:

Alle Zelllinien wurden unter konstanten Bedingungen transfiziert, wobei ein klarer Einfluss der Zelllinie auf die Transfektionseffizienz festgestellt werden konnte. Die Inkubation mit fluoreszierenden Nanopartikeln zeigte, dass alle 10 Zellinien und hMSCs die Nanopartikel aufnehmen, wobei die DNA aber in unterschiedlichem Maß abgelesen und zu eGFP transkribiert wird. Durch den MTT-Test wurde weiterhin ein Zusammenhang zwischen der Transfektionseffizienz und der Vitalität der Zellen nach der Transfektion mit Calciumphosphat-Nanopartikeln gezeigt. Alle Zelltypen nahmen die Nanopartikel auf, aber nicht alle Zelltypen ließen sich erfolgreich transfizieren.

Danksagung:

Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 1093 und TRR 60) für die Förderung dieses Projekts.

Referenzen:

[1] V. Sokolova, S. Neumann, A. Kovtun, S. Chernousova, R. Heumann, M. Epple, Journal of Materials Science2010, 45, 4952-4957.

[2] T. Tenkumo, O. Rotan, V. Sokolova, M. Epple, Nano Biomedicine2013, 5, 64-74.

P24

Neuartiges Kompositmaterial aus mikroporöser β-TCP Keramik und Alginatgel zur verzögerten Freisetzung von Antibiotika

*M. Seidenstücker¹, S. Kißling¹, J. Rühe², N. P. Südkamp¹, A. Bernstein¹, H. O. Mayr¹

¹Universitätsklinikum Freiburg, Freiburg, Deutschland

²Universität Freiburg, IMTEK, Chemistry & Physics of Interfaces, Freiburg, Deutschland

Einleitung:

Mikroporöses beta Tricalciumphosphat (β-TCP) hat sich in der Vergangenheit als geeignetes Material hinsichtlich Bioabbaubarkeit und mechanischer Stabilität erwiesen. Der Abbau des Trägermaterials muss dabei mit der Knochenneubildung konform gehen. Diese Voraussetzung wird durch interkonnektierende Mikroporen des ß-TCPs erfüllt (40% Porosität, 5 μm Porendurchmesser). Diese Poren eignen sich bestens um Wirkstoffe wie Antibiotika einzulagern. Ziel dieser Studie war es einen Komposit aus β-TCP, Alginat und Antibiotika zu erzeugen und damit das Freisetzungsverhalten der Antibiotika zu verlängern.

Materialien und Methoden:

Mittels der von uns entwickelten Durchflusskammer wurde bei einem gerichteten Vakuum die Befüllung der porösen Keramik mit verschieden zusammengesetzten Alginaten mit 50 mg/ml Antibitika realisiert. Nach der Vernetzung des Alginats durch Ca Ionen erfolgte die Inkubation in 10 ml bidest Wasser über 4 Wochen bei 37°C. Zu definierten Zeiten (1, 2, 3, 6, 9, 14, 20 und 28 Tagen) wurde die Flüssigkeit vollständig ausgetauscht und mittels CZE und Mikrodilutions-versuchen analysiert. Die Daten wurden als Mittelwert und Standardabweichung ausgedrückt und mittels ANOVA analysiert (p=0,05).

Ergebnisse und Diskussion:

Die Freisetzung von Vancomycin erfolgte aus dem Alginat mit externer Ca Quelle über den gesamten Zeitraum mit Konzentrationen deutlich oberhalb des MHK. Der Burstrelease hatte einen Wert von 35,2 ± 1,5 %. Für die Freisetzung von VAN aus Alginat mit interner Ca Quelle konnte nur eine Freisetzung über 14 Tage beobachtet werden. Der Burstrelease lag hier bei 61,9 ± 4,3%. Die Freisetzung von Clindamycin aus Alginat mit externer Ca Quelle konnte auch über den Freisetzungszeitraum detektiert werden. Der Burstrelease lag bei 54,1 ± 7,8% für natives und bei 40,5 ± 6,4% für steriles Alginat. Das Alginat mit interner Ca Quelle erreichte nur eine Freisetzung über 9 Tage mit einem Burstrelease von 65,9 ± 3,7 %. Die Mikrotiter Experimente zeigten für VAN eine Wirksamkeit über den gesamten Untersuchungszeitraum. Der ermittelte MHK Wert lag auch bei den Freisetzungsversuchen im Bereich von 0,5-2,0 μg/ml gegenüber Staphylococcus aureus. Die Wirksamkeit von CLI war nur über 20 Tage mit Werten im Bereich von 0,0 - 0,5 μg/ml gegenüber Staphylococcus aureus gegeben.

Aufgrund der Vernetzung des Alginats konnte eine längerfristige Freisetzung über 4 Wochen erreicht werden. Die freigesetzten Konzentrationen an Antibiotika lagen bis zum letzten untersuchten Zeitpunkt deutlich oberhalb der MHK gegenüber Staphylococcus aureus. Die mikrobiologischen Untersuchungen kamen zum gleichen Schluss. Nach diesem Verfahren beladene Dübel eignen sich für weitere Versuche in vitro und vivo.

Abbildung 1

Abb.1:

Releasekinetiken der Antibiotika aus ß-TCP Scaffolds; a: normierte Vancomycinfreisetzung; b: absolute Vancomycinfreisetzung im Vergleich zur MHK (grüne Linie); c: absolute Clindamyicinfreisetzung; d: absolute Clindamycinfreisetzung im Vergleich zur MHK (rote Linie).

P25

Anpassung eines Wirkstofffreisetzungssystems bestehend aus dem Antibiotikum Gentamicin und dem Matrixpolymer Poly(Lactid-co-Glycolid) an den im Defektvolumen geforderten Dosierungsbereich

*A. Breier¹, J. Friedrichs¹, B. Rentsch², G. Heinrich^1,3

¹Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden e.V., Dresden, Deutschland

²Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung, Dresden, Deutschland

³Technische Universität Dresden, Institut für Werkstoffwissenschaft, Dresden, Deutschland

Einleitung:

Bei der Sanierung großer segmentaler Knochendefekte besteht das Risiko einer fremdkörperassoziierten Infektion. Durch die Integration eines Wirkstofffreisetzungssystems in ein bestehendes textiles Knochenimplantat soll dieses gemindert werden.

Materialien und Methoden:

Der Wirkstoff Gentamicin wird in einer degradierbaren Polymermatrix bestehend aus Polylactid (PLA) bzw. Poly(Lactid-co-Glycolid) (PLGA) immobilisiert, was eine zeitlich verzögerte Freisetzung bewirkt. Das Wirkstofffreisetzungssystem wird durch Beschichtung der textilen Scaffolds mittels Dip-Coating eingebracht. Die Freisetzung soll über einen Zeitraum von 96 h in einem aus der systemischen Anwendung des Antibiotikums berechneten und auf den Defektraum angepassten Dosierungsbereich stattfinden.

Ergebnisse und Diskussion:

Aus den drei Beschichtungsmethoden „Suspension“, „Emulsion“ und „Schichtaufbau“, die jeweils über eigene Parameter zur Beeinflussung des Freisetzungsprofils verfügen, wurde die Methode „Suspension“ und die damit verbundenen Einflussfaktoren Korngröße, Korngrößenverteilung sowie Masseanteil des Antibiotikums und Schichtdicke der aufgetragenen Polymerschicht als die günstigste herausgearbeitet.

Durch optimale Kombination der gegebenen Parameter sowie eine geeignete Auswahl des Matrixpolymers konnte die Freisetzung soweit optimiert werden, dass über einen Zeitraum von 60 h eine Freisetzung im festgelegten Dosierungsbereich stattfindet. Die Dosierung liegt dabei weit unter der von einem auf dem Markt befindlichen Gentamicin-beladenen Knochenzement und oberhalb einer vergleichbaren und als antibakteriell wirksam eingestuften Beschichtung. Die durch die Freisetzung erreichten Antibiotikum-Konzentrationen zeigten eine gute Zellverträglichkeit und eine ausreichende mikrobielle Wirksamkeit.

P26

Release of Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) from Nanoporous Silica Nanoparticles for Neuronal Applications

*N. Schmidt¹, T. Heemeier¹, A. Satalov¹, J. Schulze², A. Warnecke², P. Behrens¹

¹Leibniz Universität Hannover, Institut für Anorganische Chemie, Hannover, Deutschland

²Hannover Medical School, Department of Otorhinolaryngology, Hannover, Deutschland

Introduction:

Sensorineural deafness is caused by a damage of hair cells followed by a successive degeneration of spiral ganglion neurons (SGNs). This deafness can be treated by a cochlear implant. To optimize the biocompatibility and the electrode-nerve contact the implant surface has to be provided with a bioactive function. A potent approach is to establish drug delivery systems on the surface which can release e.g. neuroprotective factors.^[1,2] Previous studies have demonstrated that the growth factor, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), is a promising agent due to its ability to improve the survival and the growth of SGNs.^[2] In different studies nanoporous silica nanoparticles (NPSNPs) have shown a good biocompatibility, and that they are suitable as delivery platform.^[3] The advantageous properties of NPSNPs include a high surface area, a large pore volume, a variable and tunable pore size and the ability for surface modification.^[4]

Materials and Methods:

In the current study, NPSNPs were prepared via the sol-gel process from alkaline aqueous solution.^[5] The particle surface was modified by post-grafting reactions using different trialkoxysilanes to equip the surface with various functional groups. The interaction of these groups with BDNF was studied. In addition, the immobilization and the subsequently release of BDNF from different modified NPSNPs were investigated. The immobilized and released amounts of BDNF were determined by using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

Results and Discussion:

The synthesized NPSNPs were nearly 40 nm and had a high surface area. All three types of NPSNPs (non-modified, sulfonic acid-modified and amino-modified) have shown high amount of immobilized BDNF of nearly 100%. The highest released amount over a period of 60 days was determined for the amino-modified NPSNPs.

Acknowledgement:

This work was supported by the Cluster of Excellence Hearing4all.

References:

[1] Stöver, T. et al.; GMS Curr. Top. Otorhinolaryngol. - Heck Neck Surg., 2009, 8, 1-22.

[2] Warnecke, A. et al.; PLOS One, 2014, 9, 1-10.

[3] Vivero-Escoto, J.L. et al.; Small, 2010, 6, 1952-1967.

[4] Mamaeva, V. et al.; Adv. Drug Delivery Rev., 2013, 65, 689-702.

[5] Qiao, Z.-A. et al., Chem. Mater., 2009, 21, 3823-3829.

P27

Cyclodextrin polyrotaxanes for drug delivery

*J. Hilschmann¹, G. Kali¹, G. Wenz¹

¹Universität des Saarlandes, Organische Makromolekulare Chemie , Saarbrücken, Deutschland

Introduction:

Cyclodextrins spontaneously form complexes with many linear polymers, such as polyethers, polyesters or polysiloxanes in aqueous media due to hydrophobic interactions.^[1] Our highly water-soluble ionic polymers with sufficiently long hydrophobic spacer groups, allow complexation under homogenous conditions in aqueous solution.^[2] We assembled cationic polyrotaxanes by threading a hexacationic α-cyclodextrin derivative^[3] onto ionenes at elevated temperatures (70°C), which were stable at room temperature. Also the subsequent threading of a heptacationic β-cyclodextrin derivative^[3] and a-cyclodextrin furnished a polyrotaxane without the necessity of covalent attachment of stoppers. Our cationic polyrotaxanes were especially suited for gene transfection into various cells, pointed out in the schematic drawing above. They form uniform nanoparticles, and transport DNA and RNA into cancer cells.^[4]

Materials and Methods:

The polyrotaxanes were characterized at room temperature with NMR (Bruker Magnet Spin 400MHz Ultrashield plus), ITC (TA Instruments Nano ITC^2G) and optical rotation (PerkinElmer Model 241).

The polyrotaxanes were dissolved in water or Hepes with 1mg/ml concentration at room temperature under sink conditions. The drug was added in different concentrations as THF solution and stirred for one day to evaporate the THF. After syringe filtration the solution was measured photospectrometrically with a Thermo Scientific Evolution 220 UV-Vis Spectrometer.

Results and Discussion:

A new type of amphiphilic cyclodextrin polyrotaxanes is going to be presented, which is readily available and forms stable polymer micelles in water. These micelles are able to take up hydrophobic probes such as pyrene and estradiol. The incorporation of these probes within the hydrophobic part of the micelles was demonstrated by characteristic changes of the uv-vis absorption and fluorescence spectra. Because of the generally low toxicity of cyclodextrins these polyrotaxanes are very interesting candidates for the delivery of hydrophobic drugs, e.g. Docetaxel, for the treatment of cancer and other diseases.

References:

[1] G. Wenz, B.-H. Han, A. Müller, Chem. Rev.2006, 106, 782.

[2] G. Wenz, B. Keller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.1992, 31, 197.

[3] G. Wenz, C. Strassnig, C. Thiele, A. Engelke, B. Morgenstern, K. Hegetschweiler, Chem.--Eur. J.2008, 14, 7202.

[4] P. Dandekar, R. Jain, M. Keil, B. Loretz, L. Muijs, M. Schneider, D. Auerbach, G. Jung, C.-M. Lehr, G. Wenz, J. Controlled Release2012, 164, 387.