Biokompatibilität III: Scaffolds für den Gewebeersatz

V59

Wiederherstellung der Bandscheibenbiomechanik durch Polyurethan Scaffolds als minimal invasive Behandlungsalternative bei degenerativer Bandscheibenerkrankung

*G. Lang^1,2, Z. Li², X. Chen², H. Sacks³, A. Yayon⁴, F. Weber⁵, H. Schmal¹, N. Südkamp¹, M. Alini², S. Grad²

¹Universitätsklinik Freiburg, Department für Orthopädie und Unfallchirurgie, Freiburg, Deutschland

²AO Research Institute, Musculoskeletal Regeneration, Davos, Schweiz

³Nicast Ltd., Lod, Israel

⁴ProCore Bio Med Ltd., Ness Ziona, Israel

⁵Universitätsspital Zürich, Klinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Zürich, Schweiz

Einleitung:

Gegenüber der Wirbelkörperfusion und der Bandscheibenprothese bietet Nucleus-pulposus-Ersatz eine minimal invasive und innovative Alternative zur Behandlung der degenerativen Bandscheibenerkrankung. Zur Wiederherstellung der nativen biomechanischen Bandscheibeneigenschaften durch Imitation des Nucleus pulposus (NP) wurde kürzlich ein neuer Polyurethan Scaffold (PUS) mit Schwellvermögen und ein Fibrinogen-Hyaluronsäure Hydrogel (FBG-HA) entwickelt. Das Ziel dieser Studie war es die mechanischen Eigenschaften des PUS und des FBG-HA Hydrogels in einem Organkultur-system unter dynamischer Belastung zu evaluieren.

Materialien und Methoden:

Die diskoiden PUS wurden aus einem PU Hydrogel basierendem Kern mit Schwellvermögen entwickelt, der umgeben ist von zwei Nanofiber-Folien. Die FBG-HA Lösung wurde mit 235 kDA bei einem FBG/HA w/w Verhältnis von 17:1 synthetisiert. Die FBG-HA Hydrogele wurden aus 2/3 FBG-HA-Volumen und 1/3 Thrombinlösung (5.2 U/ml) hergestellt. Bovine Bandscheiben wurden nukleotomiert und der Defekt gefüllt mit (1) PUS bzw. (2) PUS umgeben von 50-80 μl FBG-HA. Der Defekt an der Endplatte wurde verschlossen durch das endogene Endplattenstück und Polymethylmethacrylat. Nicht befüllte Bandscheiben dienten als Negativkontrolle. Die Biomaterialen wurden in einem Organkultursystem unter dynamischer Belastung für 14 Tage bei 0-0.1 MPa, 0.1 Hz für 3 Stunden pro Tag evaluiert. Um die mechanischen Reparatureigenschaften zu bewerten wurden die Bandscheibenhöhe und das komplexe Schubmodul an verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Hinsichtlich Histologie wurde die Safranin O/Fast Green Färbung durchgeführt. One-way ANOVA wurde genutzt um die Ergebnisse auf statistische Signifikanz zu untersuchen.

Ergebnisse und Diskussion:

Alle Implantatgruppen erhielten die Bandscheibenhöhe nach dynamischer Belastung, wohingegen sie in der negativen Kontrollgruppe um 7% sank (p<0.001). Der PUS und die Zugabe des FBG-HA Hydrogels sorgten für eine sofortige Wiederherstellung des komplexen Schubmoduls gegenüber der negativen Kontrollgruppe (PUS: 73±21%; p<0.05 vs. Negativkontrolle: 25±5%).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass der PUS in der Lage ist die mechanischen Bandscheibeneigenschaften wiederherzustellen. Die Zugabe des FBGHA Hydrogels beeinträchtigt das Schwellvermögen des PUS in situ nicht.

V60

Functionalized fiber based scaffolds for in situ bone tissue engineering

*M. Wöltje¹, R. Brünler¹, C. Adamzyk², D. Aibibu¹, M. Böbel³, G. Müller-Newen⁴, S. Ernst², S. Neuss^2,5, C. Cherif¹

¹Institut für Textilmaschinen und Textile Hochleistungswerkstofftechnik/TU Dresden , Dresden, Deutschland

²Institut für Pathologie / RWTH Aachen, Aachen, Deutschland

³Spintec Engineering GmbH, Aachen, Deutschland

⁴Institut für Biochemie und Molekularbiologie / RWTH Aachen, Aachen, Deutschland

⁵Helmholtz-Institut für Biomedizinische Technik/RWTH Aachen, Zell- und Molekularbiologie an Grenzflächen, Aachen, Deutschland

Introduction:

Tissue engineering includes three steps: 1) scaffold design to mimic the natural environment of a target tissue, 2) selection of appropriate cell types which could be readily isolated, expanded, and differentiated, 3) implantation to reconstitute function in vivo. This strategy scientifically sounds coherent, but transfer into clinics bears many obstacles in terms of regulatory requirements. Because constructs of cells or tissues that have been modified to repair, regenerate or replace human tissues are classified as Advanced-therapy medicinal products (ATMP). Thus, they have to be evaluated for safety and efficacy like any other conventional medicine which means long timescale and high costs until experimental products might reach clinics. Therefore, this study targets a scaffold design suitable to enable cellular ingrowth, vascularization and tissue reconstruction in situ.

Materials and Methods:

Transgenic silkworms were generated to functionalize silk proteins with human platelet derived growth factor (hPDGF). Silk fibers were spun presenting hPDGF or osteoconductive ceramic materials (hydroxyapatite, HA and beta-tri-calcium-phosphate, ß-TCP). Applying short fiber based Net Shape Nonwoven (NSN) technology, interconnected porous 3D constructs were manufactured. Scaffolds were characterized in terms of porosity, compressive strength, and cyclic load. Cytocompatibility was evaluated by monitoring viability of human mesenchymal stem cells (MSC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Osteogenic differentiation was determined by realtime PCR. Spatial distribution and vascularization were visualized by laser scanning microscopy.

Results and Discussion:

Fiber based scaffolds showed cytocompatibility and a tendency of increased proliferation of HUVEC and co-cultured MSC was observed on PDGF-functionalized silk. MSC cultured on HA- and ß-TCP/HA-functionalized silk scaffolds expressed higher levels of osteogenic marker genes (Runx2, ALP). Capillary-like structures were observed in all scaffold types, whereas higher matrix density and more capillary-like structures were observed in HA- and PDGF-presenting scaffold types. In conclusion, 3D interconnected porous scaffolds were generated suitable to enhance bone regeneration in situ.

Figure 1

V61

In-vivo-Untersuchung prävaskularisierter und angieogenese-fördernder Polysaccharid-Hydrogele zur Behandlung von Knochendefekten

*U. Ritz¹, H. Isabelle², P. Frank², A. Hofmann¹, P. M. Rommens¹, U. Jonas²

¹Universitätsmedizin Mainz, Zentrum für Orthopädie und Unfallchirurgie, Biomatics-Gruppe, Mainz, Deutschland

²Universität Siegen, Makromolekulare Chemie, Siegen, Deutschland

Einleitung:

Die Frakturheilung bei Defekten kritischer Größe und das damit verbundene Infektrisiko stellen Chirurgen auch heute noch vor Probleme, weshalb der Bedarf nach einem prävaskularisierten oder die Angiogenese/Vaskularisierung fördernden Biomaterial groß ist. Polysaccharid-Hydrogele zeigen optimale Voraussetzungen für den Einsatz als Trägermatrix im Bereich des Tissue Engineerings des Knochengewebes, da sie hydrophil und biodegradierbar sind, Zellwachstum fördern, die Porengröße frei gewählt werden kann und die Möglichkeit der kovalenten Proteinkopplung besteht. In unseren Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass Polysaccharid-Hydrogele die Proliferation, die Migration sowie die spezifische Genexpression verschiedener Zelltypen (Endothelzellen, primäre humane Osteoblasten, sowohl in Mono- als auch Kokulturen) unterstützen. Damit konnten wir zum einen prävaskularisierte Matrizes erzeugen sowie die Angiogenese-förderne Wirkung gekoppelter Proteine (SDF-1 - stromal derived factor-1) nachweisen. Der Nachweis, ob diese Polysaccharidhydrogele auch in vivo in der Lage sind in einem Defektmodell kritischer Größe der Kalotte der Maus Knochenheilung zu induzieren, wird in dem aktuellen Projekt durchgeführt.

Materialien und Methoden:

Fotovernetzte polysaccharid-basierte Hydrogelen auf der Basis des Polysaccharids Dextran modifiziert mit Silika-Nanopartikeln und Gelatine wurden nach einem Standardprotokoll auf Well-plates hergestellt. Vor den Tierversuchen wurden die Endotoxinkonzentration und die Zytotoxizität dieser Hydrogele analog zur Din Norm 10993-5 bestimmt. Nach dem Quellen wurden zum einen Endothelzellen und Osteoblasten als Mono- bzw. Kokulturen auf die Hydrogele ausgesät zum anderen wurde SDF-1 mit EDC/NHS an die Hydrogele gekoppelt. Diese modifizierten Dextranhydrogele wurden in einem etablierten Kalottendefektmodell der Maus zur Analyse der Frakturheilung eingesetzt. Als Nachweismethoden der Frakturheilung dienten μCt und Immunhistologie.

Ergebnisse und Diskussion:

Die Endotoxinkonzentration der Dextranhydrogele lag unterhalb der von der FDA gesetzten Grenze von 0.5 EU/ml und sie zeigten keinerlei Zytotoxizität gegenüber den eingesetzten Zellen. Der Kalottendefekt kritischer Größe (Durchmesser 2,3 mm) wurde bei der Positivkontrolle mit BMP7 komplett durchwachsen, wohingegen bei der Negativkontrolle (Hydrogele ohne Zellen oder SDF-1) keinerlei Knochenwachstum nachgewiesen werden konnte, was die richtig gewählte Größe des kritischen Knochendefektes zeigt. Interessanterweise war das Knochenwachstum bei den Hydrogelen modifiziert mit SDF-1 deutlich besser als bei den Hydrogelen mit humanen Osteoblastemn sowohl in Mono- als auch in Kokultur. Die Hydrogele mit Monokulturen aus Endothelzellen zeigten das zweitbeste Knochenwachstum. Dies spricht dafür, dass zum einen die Endothlezellen wichtiger sind als die Osteoblasten, wichtige Rolle der Angiogenese. Was auch bestätigt wird durch den positiven Einfluss des Wachstumsfaktors SDF-1, der sowohl die Migration endothelialer Zellen fördert als auch die Neo-Angiogenese. Betrachtet man den Aufwand der Herstellung prävaskularisierter Kontrukte im Vergleich zu mit Proteinen modifizierten Hydrogelen, ist der Einsatz von Hydrogelen als Trägermatrix von Zytokinen deutlich vielversprechender als der Einsatz von Hydrogelen als Trägermaterial von Zellen. Dieses Modell stellt einen vielversprechenden Ansatz für den Einsatz als biologisches Trägermaterial in verschiedenen Bereichen und Fragestellungen der Medizin, insbesondere im Bereich der Knochenreneration, dar.

V62

Simultane osteogene und chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in biphasischen Scaffolds aus marinen Kollagenen

*A. Bernhardt¹, B. Paul¹, S. Brüggemeier¹, M. Gelinsky¹

¹TU Dresden, Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung, Dresden, Deutschland

Einleitung:

Biphasische Scaffoldmaterialien zur Regeneration osteochondraler Defekte wurden bereits aus vielfältigen Materialien hergestellt. Die simultane chondrogene und osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC) erfordert außerdem ein Medium, das beide Differenzierungsrichtungen unterstützt. In der vorliegenden Arbeit wurden biphasische, aber monolithische Scaffolds, die aus biomimetisch mineralisiertem Kollagen aus Lachshaut für die Knochenphase und aus fibrilliertem Kollagen der Qualle Rhopilema esculentum für die Knorpelphase zusammengesetzt sind, für die simultane osteogene und chondrogene Differenzierung von hMSC in vitro getestet.

Materialien und Methoden:

Biphasische monolithische Scaffolds wurden durch Übereinanderschichten von Suspensionen aus biomimetisch mineralisiertem Lachskollagen und fibrilliertem Quallenkollagen nach Gefriertrocknung und chemischer Quervernetzung erzeugt (Abb. 1). Zellkulturmedien verschiedener Zusammensetzung wurden zur Induktion der chondrogenen und osteogenen Differenzierung von hMSC in monophasischen Kollagenscaffolds überprüft. Biphasische Scaffolds wurden mit hMSC und osteogen vordifferenzierten hMSC besiedelt und über drei Wochen kultiviert. Die osteogene bzw. chondrogene Differenzierung der Zellen wurde durch Genexpressionsanalysen sowie die Quantifizierung extrazellulärer Matrix in den Scaffoldphasen evaluiert.

Ergebnisse und Diskussion:

Stabile biphasische Kollagenscaffolds mit geeigneter Porosität für die Zellbesiedlung konnten aus den genannten Kollagenen marinen Ursprungs generiert werden. Ein Cocktailmedium zur simultanen osteogenen und chondrogenen Differenzierung wurde entwickelt. Weiterhin wurde ein sequentielles Besiedlungsverfahren der biphasischen Scaffolds etabliert. Chondrogen und osteogen differenzierte hMSC wurden erfolgreich in den biphasischen Scaffolds kultiviert. Die zusätzliche Verwendung von Alginatgel im Knorpelteil unterstützte die Expression chondrogener Marker und die Produktion extrazellulärer Matrix. Die osteogene und chondrogene Differenzierung von hMSC wurde maßgeblich durch die Scaffoldumgebung und Besiedlungsdichte beeinflusst.

Abbildung 1

V63

Elektrogesponnene Gelatinevliese mit variablen Eigenschaften für die Geweberegeneration

*S. Meskath¹, S. Schulz², T. Steinberg², A. Bernstein¹

¹Uniklinik Freiburg, Department Orthopädie und Unfallchirurgie, Freiburg i. Br., Deutschland

²Uniklinik Freiburg, Orale Biotechnologie, Freiburg i. Br., Deutschland

Einleitung:

In der regenerativen Medizin wird die Therapie generell auf spezifische Gewebearten abgestimmt, da verschiedene Zelltypen sich auf unterschiedlichen Geweben anders verhalten. Die Bildung eines 3D-Konstrukts welches die extrazellulären Matrix (EZM) des entsprechenden natürlichen Gewebes nachahmt um ideale Wechselwirkungen zwischen Zellen und Matrix zu erreichen ist Ziel des Tissue Engineerings. Neben anderen Ansätzen verfolgt hierbei eine Strategie den Aufbau von künstlichem Gewebe aus Nanofasern.

Dabei ist die Herstellung von Vliesen aus Nanofasern via Elektrospinnen in den letzten Jahren wieder verstärkt in den Focus der Wissenschaft geraten [1]. Durch Anlegen einer Spannung (typischerweise zwischen 10 und 40 kV) zwischen einer Polymerlösung und einer Sammelelektrode (Platte oder rotierende Trommel) werden mithilfe des elektrischen Feldes Nanofasern abgeschieden die - ungeordnet verteilt und geschichtet - das Vlies ausbilden.

Die elektrogesponnenen Vliese bilden die extrazelluläre Matrix des Gewebes bezüglich der Größenordnung und Morphologie nach. Im Rahmen der Arbeiten wird das Ziel verfolgt mit gewebe-relevanten einfachen und körpernahen in vitro Zellsystemen humanen Ursprungs neuartige Biomaterialien für kleine und große Gewebedefekte von Weich- und mineralisiertem Geweben so weiterzuentwickeln, dass sie auf das jeweilige Zielgewebe sowie dessen biomechanischen Erfordernissen optimiert werden.

Materialien und Methoden:

Die Herstellung der Vliese erfolgt via Elektrospinnen mit variabler Spannung, Elektrodenabstand, Kanülengröße und Polymerkonzentration. Durch Variation der Parameter lassen sich Vliese mit unterschiedlicher Faser- und Vliesdicke herstellen. Bei einem typischen Vlies wird zwischen 12 Kanülen (14G, Ø=2,1 mm) und einer rotierenden Trommel im Abstand von 13 cm eine Spannung von 36 kV angelegt. Über eine Spritzenpumpe wird den Kanülen eine 16%ige Gelatinelösung zugeführt (35 ml/h), wobei sich an der Trommel aus den sich abscheidenden Nanofasern das Vlies ausbildet.

Modifizierte Gelatine-Vliese wurden zum einen hergestellt durch Beimischungen von Hydroxylapatit(HA)-Nanopartikel zur Gelatine-Lösung, sowie durch Co-Spinnen der Gelatinelösung mit einer Polyethylenglycol(PEG)-Lösung, bzw. einer Kombination beider Verfahren. Durch späteres Auswaschen der PEG-Fasern entstehen Vliese mit erhöhter Porengröße. Die physikalische Charakterisierung der Vliese erfolgte mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie, sowie der Bestimmung der E-Moduln durch Indentation.

Für die Zellversuche wurden die Vliese in Zellkulturmedien in Zellkulturschalen überführt und mit dem entsprechenden Zelltyp auf der Vliesoberfläche besiedelt. Die histologischen Untersuchungen zur Proliferation und Differenzierung umfassten Zellzählungen, DAPI-Färbungen sowie Live/Dead Assays zum Nachweis vitaler Zellen. Zusätzlich wurden von den angefärbten Präparaten Kryoschnitte angefertigt um die Migration der Zellen in das Vlies zu untersuchen.

Abbildung 1: REM-Aufnahme eines Gelatine-Vlies mit 4% Hydroxylapatit-Nanopartikel

Ergebnisse und Diskussion:

Im internen Forschungsverbund der beteiligten Kliniken wurde die Verwendung der Gelatine-Vliese für verschiedene Anwendungen mit jeweils unterschiedlichen Zelltypen untersucht.

Corneale Fibroblasten und Keratinozyten für die Weichgeweberegeneration wurden in der Augenheilkunde auf den Vliesen kultiviert. Hierbei zeigte sich eine gute Adhäsion und Proliferation der Fibroblasten und auch Keratinozyten auf dem Vlies.

Zur Unterstützung der Vaskularisation wurden in der Plastischen Chirurgie HUVECs (menschliche Endothelzellen) auf den Vliesen kultiviert und mittels DAPI-Färbung nachgewiesen. Hierbei zeigte sich nur eine geringe Proliferation der HUVECs.

Zur Untersuchung der osteochondralen Regeneration wurden in der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie die Vliese mit Osteoblasten besiedelt, bei ebenfalls erfolgreicher Proliferation auf der Vliesoberfläche. Hierbei erwies sich die Verwendung inkorporierter HA-Nanopartikel als proliferationsfördernd.

Auch bei der Besiedlung der Vliese mit hMSCs (humane mesenchymale Stammzellen) für die Regeneration des Zahnhalteapparates erwies sich die Verwendung von HA und größerer Poren im Vlies vorteilhaft sowohl für die Proliferation als auch für die Migration der Zellen ins Vliesinnere.

Referenzen:

1. Liu, W., S. Thomopoulos und Y. Xia, Electrospun Nanofibers for Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials, 2012, 1(1), S. 10-25.http://dx.doi.org/10.1002/adhm.201100021

Anhang 1

Abbildung 1

REM-Aufnahme eines Gelatine-Vlies mit 4% Hydroxylapatit-Nanopartikel

V64

Vergleichende Analyse von histologischen, biochemischen und biomechanischen Parametern in Knorpelregeneraten nach MACT mit 6 und 12 Monaten Standzeit im Großtier-Modell Schaf

*P. Föhr¹, V. Kopsch², J. Mika³, L. Bischoff⁴, J. Borgwardt⁴, S. Bischoff², M. Endres⁵, C. Kaps⁵, H. Schubert², S. Pietsch⁴, R. Burgkart¹, R. W. Kinne²

¹Technische Universität München, Lehrstuhl für Orthopädie und Sportorthopädie, München, Deutschland

²Universitätsklinikum Jena, Jena, Deutschland

³Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Giessen und Marburg, Deutschland

⁴Waldkrankenhaus "Rudolf Elle" GmbH, Eisenberg, Deutschland

⁵TransTissue Technologies GmbH, Berlin, Deutschland

Einleitung:

In der “Guideline on Human Cell-Based Medicinal Products” der “European Medicines Agency” (EMA) werden neben der Testung von Biokompatibilität, evt. Toxizität sowie pharmakologischen Wirkungen weitere standardisierbare Methoden der Qualitätssicherung gefordert. Daher untersucht diese prä-klinische Studie fünf unterschiedliche histologische, biochemische und biomechanische Methoden zur isolierten oder kombinierten Charakterisierung von Knorpelregeneraten nach Matrix-assoziierter autologer Knorpeltransplantation (MACT) in dem von der EMA empfohlenen Großtier-Modell Schaf.

Materialien und Methoden:

Insgesamt wurden 24 weibliche Merinoschafe in drei randomisierten Gruppen in die Studie einbezogen. In allen Gruppen wurden zwei Knorpeldefekte von kritischer Größe (8 x 8 cm) in der Haupt-Belastungszone auf dem rechten, medialen Femurkondylus gesetzt. Einer der Defekte wurde nicht bedeckt (Leerkontrolle/“leer“), der zweite Defekt hingegen erhielt ein zellbesiedeltes Implantat auf Basis von Polyglykolsäure (PGA; „Verum“). Sechs Monate später wurde auch das kontralaterale Knie nach demselben Muster behandelt, ehe die Tiere nach 12 Monaten getötet wurden. Die behandelten Bereiche wurden standardisiert entnommen und den unterschiedlichen Untersuchungsmethoden zugeteilt: Bestimmung der Knorpeldicke („Dicke“), Histologie (H&E Färbung, ausgewertet mittels „ Modifiziertem O’Driscoll Score“ für Knorpelgewebe), Glykosaminoglykangehalt („GAG-Gehalt“), Messung der Einsinktiefe eines Prüfstempels unter konstanter Last (δ=0,11 MPa über 60 s, „Kriechen“) und Steifigkeitsmessung durch Indentation (d=1,3 mm, v=0,1 N/s, „Steifigkeit“) mit Hilfe eines neu entwickelten, hochdynamischen Prüfsystems unter aktiver Kraftregelung. Die Methoden wurden bezüglich der Unterschiede zwischen dem Leerdefekt und dem „Verum-Impantat“ sowie zwischen den Standzeiten von 6 und 12 Monaten mit einem nicht-parametrischen Test für abhängige Proben statistisch ausgewertet (Wilcoxon-Test; p < 0.05).

Ergebnisse und Diskussion:

Während die Mittelwerte für Knorpeldicke, Knorpel-Score, GAG-Gehalt und Kriechversuch in „Leerdefekt“ und „Verum“Gruppen zwischen 6 und 12 Monaten tendenziell/signifikant anstiegen (teilw. bis zur Annäherung an den nativen Knorpel), fiel die Steifigkeit in beiden Gruppen tendenziell/signifikant ab (Abbildung 1; Werte vergleichbar zw. 12 Monats-“Verum” Gruppe und Kontrolle). Außerdem ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen „Leerdefekt“ und „Verum“ nach 6 Monaten (Knorpel-Score, GAG-Gehalt, Kriechversuch) oder 12 Monaten (Steifigkeit).

Die Ergebnisse zeigen, dass die Knorpelregeneration in den „Leerdefekt“ und „Verum“Gruppen nach 6 Monaten noch nicht vollständig abgeschlossen ist. Z. T. signifikante Unterschiede zwischen den „Leerdefekt“ und „Verum“ Gruppen nach 6 oder 12 Monaten belegen die Eignung des hier verwendeten Großtier-Modells Schaf sowie der Analyseparameter zur Qualitätskontrolle und Differenzierung von Knorpelimplantaten gegenüber der Leerkontrolle. Direkte Zusammenhänge zwischen den verschiedenen Ergebnissen, die sich z. B. zwischen GAG-Gehalt und Steifigkeit andeuten, sollen durch sequentielle Parallelbestimmungen und Korrelationsanalysen untersucht werden. Die multimodalen experimentellen Daten können zudem als Parameter bzw. Randbedingungen in numerische Modelle einfließen, mit deren Hilfe das Verständnis der Zusammenhänge zwischen den zellulären, biochemischen und biomechanischen Verbesserungen der Knorpelqualität nach MACT verbessert werden kann.