Grenzflächen Biosystem und Biomaterial

P28

Histologische, kernspintomographische und klinische Ergebnisse nach endoskopischem Einsatz von azellulärer dermaler Matrix (dezellularisierte humane Dermis, Epiflex) zur Augmentation von Rotatorenmanschettenmassenrupturen der Schulter bei 97 Patienten

*W. Kunz¹, H. König², C. Weiler³

¹Atlas-Klinik, Orthopädie, Neuhausen/Stuttgart, Deutschland

²Radiologische Gemeinschaftspraxis, Radiologie, Esslingen, Deutschland

³Institut für Pathologie Olgakrankenhaus Stuttgart, Pathologie, Stuttgart, Deutschland

Einleitung:

Massive Rotatorenmanschettendefekte (mRMD) der Schulter werden unterschiedlich klassifiziert und es besteht kein therapeutischer Konsens in Bezug auf die Behandlung. Im Folgenden wird eine Alternative zu aktuellen Therapien mit Muskeltransferplastiken und Inverser Prothese durch die endoskopische Implantation azellulärer dermaler Matrix (adM) bei mRMD beschrieben und das histologische, kernspintomographische als auch klinische outcome aufgezeigt.

Materialien und Methoden:

Mit der demographischen Entwicklung steigt der Anspruch der funktionellen Gelenkerhaltung. Bei insgesamt 97 Patienten mit einem Durchschnittsalter von 73 Jahren führten wir im Zeitraum von 2005 -2013 eine sogenannte arthroskopische "PATCH" Augmentation mit adM in 2-Lochtechnik bei mRMD > 5cm (n. Bateman) durch. Bei allen Patienten wurde prä-OP eine MRT Untersuchung durchgeführt und auswärts bereits bei mRMD die Indikation zur Inversen Prothese bzw. einer Muskeitransferplastik gestellt. Bei allen Patienten erfolgte eine klinische Funktionsprüfung. Dominierend waren neben der Funktionseinbuße Schulterschmerzen, vor allem nachts. Die klinische Nachuntersuchung erfolgte anhand des "Constant Shoulder Scores" und einer visuellen analogen Schmerzskala nach 10 Tagen, 6 Wochen, 6 Monaten und nach 12 und 18 Monaten. Hierbei fand sich eine signifikante Verbesserung für die Schulterfunktion und vor allem für die Schmerzreduktion mit P=.001.

Nach postoperativen Traumen erfolgten bei Re-Eingriffen histologische Auswertungen nach 8 Wochen, 6, 8, 18 und 36 Monaten. Die Biopsien zeigten ein gutes integratives Einheilungsverhalten mit Fibroblasten- und Gefäßbesiedelung der adM mit bindegewebiger Durchbauung und nach 36 Monaten ein sogennates remodelling des scaffolds. MRT Nachuntersuchungen konnten eine gute "PATCH" Integration ohne Rerupturen sowie vereinzelt eine Regeneration der degenerativ veränderten Rotatorenmanschette (SSP) darstellen.

Ergebnisse und Diskussion:

Die arthroskopische "PATCH" Augmentation mit der dezellularisierten humanen Spenderdermis (adM,Epiflex) bietet eine valide Alternative zur Inversen Prothese bzw. Muskeltransferplastiken bei mRMD weil das histologische Einheilungs- und Remodellingverhalten zu einer Verbesserung der Schulterfunktion und vor allem zur signifikaten Schmerzreduktion führt mit einer signifikanten Verbesserung des Constant Scores von prä-OP 56 -> OP 81. Zu vergleichbaren Ergebnissen kommt F. Alan Barber, M.D. u.a. in "The Journal of Arthroscopic and Related Surgery", Vol 28, No 1 (jan.) 2012; pp 8-15).

Bei zunehmender gesellschaftlicher Alterung mit steigendem sportlichen Bewegungsanspruch bietet die arthroskopische Rotatorenmanschetten Augmentation mit adM bei gutem integrativem, histologischen Remodelling eine konkurrierende alternative Therapieoption zur Inversen Prothese und aufwendigen Muskeltarnsfertechniken, aber auch zur "limited goals surgery" mit Spacerinterpositionierung oder dem einfachen debridierenden Eingriff als "salvage procedure".Die adM hat sich als scaffold zur Rotatorenmanschettenaugmentation bewährt.

P30

Quantifizierung von S. aureus-Biofilmen auf vaskulären Gefäßprothesen zur Evaluierung der antimikrobiellen Aktivität von Bakteriophagen-Endolysinen

*M. Herten¹, T. Bisdas¹, D. Knaak², K. Becker², G. Peters², G. Torsello¹, E. Idelevich²

¹Uniklinikum Münster, Klinik für vaskuläre & endovaskuläre Chirurgie, Münster, Deutschland

²Uniklinikum Münster, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Münster, Deutschland

Einleitung:

Steigende Resistenzen und die Toleranz bakterieller Biofilme gegen Antibiotika erfordern die Suche nach alternativen antibakteriellen Wirkstoffen. Der Einsatz von Bakteriophagen-Endolysinen, wie HY-133 mit spezifischer Wirkung gegen S. aureus, könnte eine solche Alternative zur Therapie von S. aureus Biofilmen auf vaskulären Prothesen sein. Um die antimikrobielle Aktivität von Bakteriophagen-Endolysinen zu evaluieren, ist eine Quantifizierung der gebildeten Biofilme notwendig. Ziel der Arbeit war der Vergleich verschiedener Testverfahren zur Biofilm-Quantifizierung.

Materialien und Methoden:

Verschiedene S. aureus-Isolate (Biofilmproduzenten) wurden in Übernachtkultur angezüchtet und auf Gefäßprothesenmaterial (Dacron, PTFE) bzw. nur auf Polystyrol in 96-Wellplatten ausgesät. Die besiedelbare Graftoberfläche wurde durch einen definierten Stanzendurchmesser von 5 mm standardisiert. Nach 4 und 18 Stunden Inkubation wurden die planktonischen Zellen mit PBS abgespült und die Biofilmkonzentration gemessen via a) Crystal-Violett Färbung der Peptidoglycan-Oberflächenmoleküle mittels Spektrophotometrie b) mitochondrieller ATP-Konzentration als Maß für die Bakterien-Viabilität mittels Chemolumineszenz c) Bestimmung der Colony-forming-Units (CFU, Lebendzellmessung) durch serielle Verdünnung, ausplattieren und auszählen.

Ergebnisse und Diskussion:

Durch alle drei Messverfahren konnten Biofilme auf der Polystyroloberfäche detektiert und quantifiziert werden. Die spektrophotometrische Messmethode (Crystal-Violett) war jedoch auf den Gefäßprothesenmaterialien (Dacron und PTFE) aufgrund einer unspezifischen Hintergrundfärbung der Grafts nicht einsetzbar. Auf den Gefäßprothesenmaterialien zeigten die ATP-Messung b) und die Lebendzellmessung c) vergleichbare Ergebnisse.

Aufgrund der einfacheren Handhabbarkeit und der guten Reproduzierbarkeit ist die Lumineszenz-Messung der mitochondriellen ATP-Konzentration die Nachweismethode der Wahl für Graftoberflächen und kann zur Evaluation einer antimikrobiellen Aktivität des Bakteriophagen-Endolysins HY-133 eingesetzt werden. In weiteren Untersuchungen soll ein Imprägnations-Schema für vaskuläre Prothesenmaterialien aus Polyester und PTFE entwickelt und sowohl in-vitro und später auch in-vivo im Tiermodel evaluiert werden.

P31

Zellbasierte Diagnostik: Mechanosensorik von NF1-Zellen auf mikrostrukturierten und weichen Oberflächen

K. Athanasopulu¹, R. Haupt¹, J. Khoshamouz¹, C. Frey¹, H. Brems², *R. Kemkemer³

¹Hochschule Reutlingen, Fakultät Angewandte Chemie, Reutlingen, Deutschland

²Center for Human Genetics, Leuven, Belgien

³Max Planck Institute for Intelligent Systems, Dept. New Materials and Biosystems, Stuttgart, Deutschland

Einleitung:

Charakteristische Eigenschaften von Biomaterialen gewinnen immer mehr an Bedeutung in zellbasierten diagnostischen Anwendungen. Dabei werden chemische, mechanische, wie auch topographische Eigenschaften von Materialien genutzt, um das biologische Verhalten von Zellen zu untersuchen. So werden Proliferation, Migration, Differenzierung und andere biologische Funktionen durch die Eigenschaften von Zellkultur-Materialien beeinflusst und es können in vitro zelltypspezifische oder Veränderungen der Zellreaktionen aufgrund von Erkrankungen untersucht werden.

Materialien und Methoden:

Wir konnten in vorhergehenden Studien Veränderungen in der Mechanosensorik von Fibroblasten aus NF1-Patienten beobachtet. Bei Neurofibromatose Typ 1 handelt es sich um eine autosomale genetische Erkrankung. Sie tritt sowohl in haploider (NF^+/-), als auch diploider (NF^-/-) Insuffizienz auf. In Abhängigkeit der Mutation sind diverse Krankheitsbilder zu verzeichnen, welche sich unter anderem in Form von Tumoren und Pseudarthrosen äußern können. Bei dieser Form der Erkrankung kommt es zu einer stark verzögerten Frakturheilung. Die Funktion und das Auftreten der für die Knochenheilung verantwortlichen Osteoblasten und Periostzellen hängen dabei stark von den mechanischen und topographischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix ab.

Ergebnisse und Diskussion:

In diesem Projekt wird die mechanosensorische Wahrnehmung von NF1- Zellen aus verschiedenen Spendergeweben untersucht. Durch Kultivierung von gesunden Zellen (NF^+/+) und Zellen von NF1-erkrankten Spendern auf Substraten mit definierten topographischen und mechanischen Eigenschaften soll eine Zuordnung des Genotyps ermöglicht werden bzw. Fehlfunktionen in der Reaktion auf die Signale ermittelt werden. Hierbei wird erwartet, Rückschlüsse auf Fehlverhalten der Zellen in vivo zu gewinnen, um die komplexen klinischen Symptome besser zu verstehen.

Die Zuordnung und Charakterisierung erfolgt hierbei durch Auswertung der Zellmorphologie, als auch durch Mikroskopie-basierte Charakterisierung der Adhäsionsproteine und der Zytoskelettstruktur.

P32

pH-dependent adsorption of BSA on alumina surfaces: a combined QCM-D and PM-IRRAS study

L. Lassak¹, B. Torun¹, I. Giner¹, G. Grundmeier¹, *A. Keller¹

¹Universität Paderborn, Technische und Makromolekulare Chemie, Paderborn, Deutschland

Introduction:

Understanding the biomolecular processes that govern cellular response to artificial materials is an important prerequisite for many applications including tissue engineering, regenerative medicine, and cell therapy. Albumins are a group of acidic proteins that represent the main component of plasma. Albumin adsorption may lead to a passivation of implant surfaces thereby reducing inflammatory response [1]. Here, we therefore study the adsorption of bovine serum albumin (BSA) to alumina surfaces at different pH values.

Alumina ceramics are frequently used for orthopedic and dental implants as they exhibit high wear resistance and excellent mechanical properties [2]. BSA is composed of a single polypeptide chain with 583 amino acid residues and a molecular weight of 66.4 kDa. The pI of BSA lies in the range between 4.7 and 5.6 [3], while alumina surfaces have a point of zero charge between 7 and 9 [4].

Materials and Methods:

BSA was dissolved at 0.1 mg/ml in TRIS buffer with the pH values ranging from 4.5 to 7.5 and its adsorption was investigated using quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D). In QCM-D, a piezoelectric quartz crystal is excited at its resonance frequency and the change in the resonance frequency during protein adsorption is measured. From the frequency change, the mass of the adsorbed layer can be calculated using the Sauerbrey relation [5]. By monitoring the dissipation, on the other hand, the viscoelastic properties of the adsorbed film can be analyzed.

Aluminum films with a native surface oxide have been deposited on the quartz crystals and used both as electrodes and the adsorptive surfaces. Since the oxide layer is only few nanometers thick, the conformation of the adsorbed BSA can be analyzed by polarization-modulated infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS). Here, the IR absorption of the sample is measured in reflection geometry under grazing incidence which leads to different absorption of p- and s-polarized light. The thin film of adsorbed proteins on the metal surface interacts only with the p-polarized fraction of IR light but not with the s-polarized one. In this way, the sensitivity can be enhanced by minimizing parasitic atmospheric absorption.

Results and Discussion:

The amount of adsorbed BSA is found to depend strongly on the pH of the TRIS buffer solution. Minimum adsorption is observed at high pH values, i.e., close to the point of zero charge of the alumina surface. Lowering the pH results in a continuous increase in the adsorbed mass with maximum adsorption occurring at pH values close to the pI of BSA. Adsorption kinetics, however, were only mildly affected by changes in pH with saturation levels observed after some ten minutes.

After adsorption, the conformation of the adsorbed proteins was investigated by analyzing the amide I band in PM-IRRAS spectra. Changes in secondary structure are determined by peak fitting in order to quantify the relative contributions of alpha helices, beta sheets, and turns.

References:

[1] L. Tang and J.W. Eaton, Mol. Med. 5 (1999) 351

[2] A. Marti, Injury 31 (2000) D33

[3] A. Salis at al., Langmuir 27 (2011) 11597

[4] M. Kosmulski, J. Colloid Interface Sci. 298 (2006) 730

[5] G. Sauerbrey, Zeitschrift für Physik 155 (1959) 206

P33

Hydrogel as adhesion barrier to prevent postoperative fibrosis

D. Stadel¹, E. Rist¹, L. Klumpp¹, B. Schlosshauer¹, J. Mollenhauer², H. Wurst², N. Clausen², K. Benz², K. Maleck², C. Gaissmaier², E. Odermatt³, K. Sternberg³, R. Krastev¹, *H. Hartmann¹

¹NMI, Reutlingen, Deutschland

²TETEC AG, Reutlingen, Deutschland

³Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland

Introduction:

Postsurgical adhesions often lead to pathological fibrosis which can cause severe dysfunctions of affected organs including spine, gut or uterus. Therapeutic approaches such as Seprafilm^® focus on keeping lesioned tissue surfaces apart to prevent their fibrotic adhesion. We aim to develop a new, in situ polymerizable hydrogel as adhesion barrier with the advantage that it can be applied also by spraying or in minimally invasive surgery.

Materials and Methods:

The hydrogel, termed “InGel” was produced by mixing two solutions: (1) maleimide-functionalized albumin and (2) bis-thio-polyethylene glycol (PEG). After size-exclusion chromatography, purity and stability were determined by absorbance measurement. Biological characteristics were analyzed by culturing fibroblasts on InGel to determine cell adhesion and viability (microscopy and resazurin assay). Cell migration was monitored by time-lapse video recording. InGel was applied in vivo to animals with lesions on the abdominal peritoneum and the opposing cecum. Adhesion barrier function was characterized using tensiometry and histology after 4 weeks of implantation.

Results and Discussion:

Synthesis, purification and stabilization of hydrogel components were successfully achieved. Subsequent mixing of albumin and PEG-crosslinker solutions resulted in macroscopic formation of hydrogels. The cell permissiveness of the gel surfaces was clearly restricted as evident from decreasing cell numbers in vitro. Furthermore, time lapse video recording suggested that cell migration was impaired. In vivo experiments displayed 0% adhesion for sham operated animals, whereas positive controls without adhesion barrier displayed 100% adhesions. Adhesion was clearly accompanied by strong collagen deposition as visualized by histology. Adhesion strength could be quantified successfully by tensiometry. With InGel, values in the range of Seprafilm^® could be achieved.

A resorbable hydrogel could be successfully synthesized, showing ideal physical and biological characteristics to serve as adhesion barrier. With the potential to be applied by spraying or minimally invasive surgery, InGel possesses clear advantages towards products being on the market.

Supported by BMBF 13N12454-56.

Coordinator:helmut.wurst@tetec-ag.de

P34

Self-Assembled Protein-Based Nanoarchitectures: Functional Biomaterials for in vitro and in vivo Applications

*A. Schreiber¹, M. Huber¹, S. M. Schiller¹

¹Universität Freiburg, ZBSA, Freiburg, Deutschland

Introduction:

Biogenic tectons based on de novo created proteins are a powerful tool for developing smart biomaterials. Defined control over the amino acid sequence, length and modifications allow for the selective alteration of their properties - for example, biocompatibility, temperature response and surface interaction. Applying functional engineering to the protein level we design a protein based toolbox of biogenic tectons as cellular building blocks and networks with regulatory and structural functions, which did not previously exist in nature.

Materials and Methods:

Elastin like proteins have been engineered and applied by us for the assembly of “artificial organelles”¹. Intentionally „programmed” molecular interactions of these amphiphilic protein tectons allowed for the de novo synthesis and assembly of artificial compartments in vivo and in vitro. The in vitro constitution of vesicular superstructures from protein components has been reported in the literature. However, we could for the first time show both, the assembly of protein membrane-based organelles (PMBOs) not only in vitro but also within a living cell. The defined in vivo modification of these compartments, via site-specific co-translational incorporation of unnatural amino acids and their bioorthogonal functionalization constitutes novel functional and genetically encoded organelles in E.coli.

Results and Discussion:

Adding such new nanoarchitectures based on molecularly structured biomaterials to the cellular machinery may have far reaching consequences in nanobiotechnology, synthetic biology and material science. Potential applications include drug formulation and triggered release, assembling enzyme cascades, the definition of spatially separated reaction chambers, and the constitution of artificial cells and biobased metamaterials.

References:

1. Huber MC, Schreiber A, von Olshausen P, Varga BR, Kretz O, Joch B, u. a. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nat Mater. Januar 2015;14(1):125-32.

TEM-image of a z-stack of slices of E. coli cells expressing the artificial amphiphilic protein. 3D composition of the images illustrate the spherical arrangement of artificial organelles constituted in vivo.

Figure 1

P35

Verbesserte Adhäsion von Endothelzellen auf beschichtete Oxygenatormembranen aus PMP

*K. Linke¹, M. Schandar¹, A. Wenz², K. Borchers¹, F. Metzger³, E. Novosel³, J. Schneider³, P. Kluger^1,4

¹Fraunhofer IGB, Zellsysteme, Stuttgart, Deutschland

²Universität Stuttgart IGVP, Stuttgart, Deutschland

³Novalung, Heilbronn, Deutschland

⁴Hochschule Reutlingen, Reutlingen, Deutschland

Einleitung:

Patienten mit schweren Lungenschäden, wie sie beispielsweise bei der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung auftreten, sind auf den Einsatz von Membranoxygenatoren zur Oxygenierung und Kohlenstoffdioxidentfernung angewiesen. Standardmäßig werden hierzu Hohlfasermembranen aus Polymeren, z.B. Polymethylpenten (PMP), eingesetzt, an deren Oberfläche der Gasaustausch stattfindet. Aufgrund der fehlenden antithrombogenen Eigenschaften des Fasermaterials kommt es jedoch zur Thrombenbildung, welche wiederum die Gasaustauschrate und damit die Lebensdauer der Membran verringert. Eine Endothelialisierung der Faseroberfläche soll daher antithrombogene Eigenschaften vermitteln.

Materialien und Methoden:

Aus Hautbiopsaten isolierte humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs) wurden auf die beschichteten PMP-Fasermatten ausgesät. Im Anschluss an die Adhäsion der Zellen, wurden die Fasermatten in einem Flussreaktor unter dynamischen Bedingungen kultiviert. Die Besiedlung der Fasern, sowie die Viabilität der Zellen, die Integrität des Zellmonolayers und die Expression endothelzell-spezifischer Marker wurde analysiert. Hierzu fand eine Lebend-Tot-Färbung mittels Fluoresceindiacetat und Propidiumiodid (FDA/PI), sowie Immunfluoreszenzfärbungen von vaskulärem endothelialem Cadherin (VE-Cadherin) und PECAM-1 statt.

Ergebnisse und Diskussion:

Mittels FDA/PI-Färbung wurde direkt im Anschluss an die Adhäsionszeit sowie nach 7- bis 14-tägiger dynamischer Kultur nachgewiesen, dass die Bedeckung großer Teile der Faseroberfläche mit viablen Zellen erreicht werden konnte. Die Zellen zeigten die Expression der Proteine VE-Cadherin und PECAM-1, welche wichtige Bestandteile der Zell-Zell-Kontakte innerhalb des Endothels darstellen und damit dessen Integrität - die Voraussetzung für die Antithrombogenität - widerspiegeln.

Im Gegensatz zu früheren Studien konnte in den vorliegenden Versuchen die dynamische Kultivierung primärer humaner Endothelzellen auf beschichteten PMP-Fasern verbessert werden. Eine dynamische Kultivierung unter physiologischen Flussbedingungen war ebenfalls möglich.