Biomaterialien III: Oberflächen

V53

Knochenersatzwerkstoff auf der Basis mineralisierter phosphatvorstrutkturierter Gelatine

*B. Kruppke¹, C. Kreschel¹, C. Heinemann¹, A. Wagner², H. Worch¹, S. Wenisch², T. Hanke¹

¹TU Dresden, Institut für Werkstoffwissenschaft, Max Bergmann Zentrum für Biomaterialien, Dresden, Deutschland

²Justus-Liebig-Universität Gießen, Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie, Gießen, Deutschland

Einleitung:

Methoden der Einbindung von organischen Molekülen in einen Mineralisationsprozess oder Verbundwerkstoffe aus organischen und anorganischen Bestandteilen für den Knochenersatz verfolgen ein Ziel, die Nachahmung der natürlichen Referenz - dem Knochen. Die Eigenschaftskombinationen bezüglich Festigkeit und Elastizität, Resorbierbarkeit und Biokompatibilität sind dabei bisher nicht erreicht.

Materialien und Methoden:

Die Mineralisation von, mittels phosphathaltiger Lösung vorstrukturierter, Gelatine als denaturierte Form des Kollagens mit Calcium- und Strontiumlösungen führt zu morphologisch und strukturell stark variierbaren Mineralphasen. Die Eignung dieser organisch modifizierten Minerale wurde in Bezug auf unterschiedliche Verfahren der Probekörperherstellung (verpressen und sedimentieren) untersucht. Dazu wurde die azelluläre Degradation in physiologischen Medien bestimmt und die zelluläre Reaktion von humanen mesenchymalen Stammzellen und humanen Monozyten unter Differenzierung zu Osteoblasten bzw. osteoklastären Zellen analysiert.

Die mechanische Charakterisierung erfolgte mittels ball on three balls-Test, Druck- und Spaltzugfestigkeitsprüfung, wobei Letzterer sowohl für die Analyse im trockenen Ausgangszustand als auch im feuchten Zustand nach Inkubation in Degradationsmedien zeitaufgelöst durchgeführt wurde.

Die Einbindung eines Modellwirkstoffes, dem Antibiotikum Rifampicin, zeigt die mögliche Nutzung dieses degradierbaren Knochenersatzwerkstoffes als drug delivery-System in einer Freisetzungs- und Stabilitätsstudie.

Ergebnisse und Diskussion:

Die Probekörperherstellung durch Verpressen führte zu Festigkeiten, die bis zu Faktor 10 oberhalb der Festigkeiten liegen, die bei der Probekörperherstellung mittels sedimentieren erreicht werden. Dabei zeigen die sedimentierten Probekörper die gewünschte deutlich längere Kompensation der Apatitabscheidung in physiologischen Lösungen durch die Kationenfreisetzung. Die gesteigerte osteoblastäre Differenzierung durch das gelatinemodifizierte Calcium-/Strontium-Copräzipitat lässt auf eine besonders gute Eignung als Knochenersatzwerkstoff schließen.

Danksagung:

Die Autoren danken für die Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Transregio 79/ M3.

Abbildung 1

V54

Towards smart biomaterials; Glycosaminoglycan sulfation promotes osteogenic Wnt signaling by interfering with sclerostin/LRP5/6 complex formation

*J. Salbach-Hirsch¹, S. A. Samsonov², V. Hintze^2,3, C. Hofbauer¹, A.- K. Picke¹, M. Rauner¹, J.- P. Gehrke², S. Möller^2,4, M. Schnabelrauch⁴, D. Scharnweber³, M. T. Pisabarro², L. C. Hofbauer¹

¹Uniklinikum Dresden, Endokrinologie und metabolische Knochenerkrankungen, Dresden, Deutschland

²BIOTEC, Structural Bioinformatics, Dresden, Deutschland

³Max Bergman Center of Biomaterials, Institute of Materials Science, Dresden, Deutschland

⁴INNOVENT e.V., Biomaterials Department, Jena, Deutschland

Introduction:

Osteoporotic fractures and bone defects represent an emerging challenge in musculoskeletal health of the elderly often suffering from impaired bone regeneration and delayed implant integration. A key inhibitor of bone regeneration is sclerostin (Sost) that acts by binding to LRP5/6 receptor and thereby blocks Wnt/LRP5/6 engagement. Of note, Sost contains a Heparin (Hep) binding domain that may exert regulatory properties.

Materials and Methods:

Using native and synthetically derived bone glycosaminoglycans (GAGs) such as hyaluronan (HA), chondroitin sulfate (CS) and heparin (Hep) we evaluated how GAGs modulate Sost bioactivity. GAGs were tested for their capability to bind to Sost depending on their degree of sulfation (D.S.) using surface plasmon resonance and molecular modeling. Results were validated in an LRP5/Sost interaction study and an in vitro Wnt promoter assay to quantify Wnt-signaling.

Results and Discussion:

Our study revealed that sulfated GAGs bind Sost at the Hep binding domain in a dose- and sulfate-dependent manner and inhibited the Sost/LRP5 complex formation. An intermediate dose of 100 μM GAGs inhibited complex formation of up to 94% in the presence of high sulfated GAGs (CS, HA, D.S.:3), 75% for medium sulfated GAGs (Hep, D.S.:2) and 29% for low sulfated GAGs (CS, D.S.:1). No inhibition was observed for the unsulfated HA. Furthermore, if GAGs were preincubated with Sost a partial rescue in promoter activity could be observed. Whereas the unsulfated HA had no effect, high sulfated Hep (D.S.:2) increased Wnt activity in the presence of Sost nearly threefold, sulfated HA (D.S.:3) nearly fivefold.

Here we demonstrated that GAG sulfation directly interferes with Sost bioactivity resulting in increased Wnt signaling. This data suggests, that finetuning GAG composition and restricting GAG function to surfaces could represent a suitable tool to enhance local bone regeneration. Whether this translates into a favorable profile on bone remodeling at fracture sites requires rigoros in vivo assessment.

V55

Kontrollierte, lokale Freisetzung von synthetischer messenger RNA zur Wiederherstellung der Gefäßwandbiologie

M.- K. Abraham¹, M. Salinas Medina¹, R. Reus¹, M. Avci-Adali¹, K. Peter², C. Schlensak³, H. P. Wendel¹, *S. Krajewski¹

¹Universitätsklinikum Tübingen, Forschungslabor der Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie, Tübingen, Deutschland

²Baker IDI Heart and Diabetes Institute, Melbourne, Deutschland

³Universitätsklinikum Tübingen, Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie, Tübingen, Deutschland

Einleitung:

Die Verengung von Arterien, auch als Atherosklerose bezeichnet, ist noch heute eine der häufigsten chronischen Erkrankungen, die im schlimmsten Fall durch Verursachen eines kompletten Gefäßverschlusses im Herzinfarkt oder Schlaganfall gipfeln kann. Reicht eine medikamentöse Therapie nicht mehr aus, wird neben der Bypassoperation meist eine Angioplastie durchgeführt. Dabei werden verengte oder bereits verschlossene Arterien minimal-invasiv durch Implantation eines Stents als mechanische Gefäßstütze wiedereröffnet. Allerdings entstehen hierbei teils schwerwiegende Probleme, da thrombotische Komplikationen sowie eine erneute Verengung des gestenteten Blutgefäßes (Restenose) nicht selten auftreten. Ziel ist deshalb die Entwicklung einer bioaktiven Stentbeschichtung, um die Thrombozytenaktivierung nach Stentimplantation sowie eine Restenose effektiv zu verhindern. Dabei wird eine neuartige und innovative Strategie verfolgt, bei der durch Einbringen von in vitro synthetisierten messenger RNA (mRNA) in die Zielzellen eine Neusynthese von spezifischen Proteinen induziert wird. So kann durch Beschichtung von Stents mit spezifischen mRNAs, die Synthese von z. B. antithrombotischen (CD39) und antiarteriosklerotischen (Paraoxonase-1) Proteinen in der Gefäßwand induziert werden, wodurch die Integrität des Endothels unterstützt sowie thrombotische und inflammatorische Reaktionen nach Stentimplantation inhibiert werden könnten.

Materialien und Methoden:

Mittels in vitro Transkription wurden zunächst modifizierte mRNAs, die für die Proteine CD39 und Paraoxonase-1 kodieren, generiert. Verschiedene Zelllinien und primäre Endothelzellen wurden mit den mRNAs transfiziert und die Expression wurde unter Verwendung von Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie, ELISA und Western Blot analysiert. Um die Funktionalität der exprimierten Proteine, i.e. CD39 und Paraoxonase-1, nachzuweisen, wurden durchflusszytometrische und enzymatische Tests durchgeführt. Weiterhin wurde eine Beschichtung, in der die mRNAs integriert wurden, etabliert und die indirekte Transfektion von Zellen mit nachfolgender Proteinexpression analysiert. Eine potentielle mRNA-induzierte Stimulation der Immunantwort wurde mittels real-time PCR untersucht. In weiteren in vitro Versuchen wurde die Serumstabilität der mRNA analysiert.

Ergebnisse und Diskussion:

Die in vitro Zellkulturversuche zeigten eine erfolgreiche Proteinexpression von CD39 und Paraoxonase-1 nach direkter Transfektion der Zellen. Weiterhin konnte die Funktionalität der Proteine nachgewiesen werden. Das überexprimierte CD39 Protein hydrolysiert z.B. hohe ADP Konzentrationen und verhindert dadurch die Aktivierung von Thrombozyten. Weiterhin konnte die mRNA erfolgreich auf einer Trägeroberfläche aufgebracht werden, wobei kein Funktionalitätsverlust beobachtet wurde. Die Transfektion der Zellen mit modifizierten mRNAs führte zu keiner Aktivierung von proinflammatorischen Zytokinen (IFN-α, IFN-β, TNF-α) und zeigte eine gute Stabilität sowie keinen Funktionsverlust während der Inkubation in humanem Serum.

Insgesamt bieten die Daten die Grundlage für ein völlig neues und vielversprechendes Konzept zur Therapie von atherosklerotischen Blutgefäßen jeglicher Art, womit Patienten, bei denen eine Stentimplantation unumgänglich ist, nachfolgend und sicher vor thrombotischen Komplikationen und Restenosierung geschützt werden könnten.

V56

Multischichten aus Poly-L-Lysin und Hyaluronsäure in Kombination mit geordneten Nanostrukturen beeinflussen Stammzelldifferenzierung

*M. Niepel¹, F. Almouhanna¹, B. K. Ekambaram¹, T. Groth¹

¹Martin Luther University Halle-Wittenberg , Pharmacy, Biomedical Materials , Halle (Saale), Deutschland

Einleitung:

Topographische und mechanische Signale sind wichtige Regulatoren des Zellverhaltens in Körpergeweben. Diese Studie hat zum Ziel, ein einzigartiges System mit präzisen viskoelastischen und geometrischen Parametern mittels Laserinterferenzlithographie (LIL) und der Layer-by-Layer (LBL) Technik zu entwickeln, um Stammzellen gezielt durch mechanische Stimuli für potentielle Anwendungen in der regenerativen Medizin zu steuern.

Materialien und Methoden:

Ovale, hexagonal angeordnete Nanostrukturen unterschiedlicher Größe wurden mittels LIL durch verschiedene Einfallswinkel erzeugt. Anschließend wurden Multischichten aus Poly-L-Lysin (PLL) und Hyaluronsäure (HA) durch Sprühbeschichtung auf den Nanostrukturen gebildet. Die Viskoelastizität dieser Schichten wurde durch Vernetzen unter Verwendung von 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) eingestellt. Native und modifizierte nanostrukturierte Oberflächen wurden mittels Rasterkraft- (AFM) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sowie durch Wasserkontaktwinkelmessungen (WCA) charakterisiert. Adhäsion, Wachstum und Differenzierung von humanen Fettgewebsstammzellen (hADSC) wurden untersucht, um Kenntnisse über den Einfluss der Nanostrukturen auf die zelluläre Antwort zu gewinnen.

Ergebnisse und Diskussion:

Zunächst hydrophobe nanostrukturierte Oberflächen wurden durch die Modifizierung mit den Multischichten hydrophil. AFM-Untersuchungen unter Verwendung kolloidaler Spitzen ergaben die niedrigste Viskoelastizität in Multischichten vernetzt mit der höchsten EDC-Konzentration. Adhäsion und Proliferation von hADSC wurden eindeutig von Größe und Abstand der Nanostrukturen beeinflusst und eine Periode von 518 nm erwies sich dabei als optimal. Ferner hatte der Abstand der Strukturen eine deutliche Wirkung auf die Orientierung von Zellen mit mehr länglichen Zellen auf den kleinsten Strukturen. Die fokale Adhäsionskinase (FAK) als Indikator für die mechanische Spannung auf das Zytoskelett wurde überwiegend in der Peripherie der hADSC gefunden und in erster Linie auf den Nanostrukturen, wiederum optimal für eine Periode von 518 nm. Die kleine GTPase RhoA war gleichmäßig innerhalb der hADSC ohne offensichtliche Abhängigkeit von den Strukturgrößen verteilt.

Die hier vorgestellte, neue Technik zur reproduzierbaren Erzeugen von Nanostrukturen in Kombination mit viskoelastischen Oberflächenbeschichtungen kann in Zukunft verwendet werden, um die Differenzierung von mesenchymalen und anderen Stammzellen zu steuern.

V57

Covalent Surface Modification of Carbon Fibers using Diels-Alder Chemistry

*M. Gabriel¹, M. Becker²

¹Qatar Cardiovascular Research Center, Doha, Katar

²Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg, Deutschland

Introduction:

Carbonaceous materials such as carbon fibers and graphene are frequently used in implantology (ligament replacement, electrodes) and in basic research. In order to improve the biological performance of these substrates, surface modification is desirable. Here we demonstrate a facile method to covalently graft the cell-adhesive peptide RGD onto carbon fibers using Diels-Alder chemistry.

Materials and Methods:

Surface activation of carbon fibers was achieved by treatment with maleic anhydride (MA) in dry toluene for 4 h at 100°C. Treated and pristine samples were subjected to mechanical testing and the modification was confirmed by IR spectroscopy. MA-modified samples were subsequently incubated in 0.5 mg/ml solution of RGD-Peptide for 2h, cleaned and sterilized with 50 % iso-propanol. Cell culture was performed for one and seven days using primary osteoblasts. Micrographs of fluorescent labeled cells were analyzed with ImageJ software.

Initial adhesion of bone cells after 24h was improved approx. five-fold oover peptide-modified material. A dramatic increase in cell growth by a factor 263 was observed after one week on RGD-grafted substrate compared to untreated carbon fibers.

Conclusion:

Diels-Alder chemistry performed on a carbon fibers followed by RGD-immobilization was shown to yield a highly cell-adhesive surface. Using maleic anhydride as the reagent provides a versatile platform for the subsequent covalent coupling of a wide variety of biomolecules such as proteins and peptides on carbonaceous substrates.

Figure 1

V58

Local Surface functionalization of Polymer composites with RGD for Hernia Implants

*N. Nottrodt¹, S. Gillner¹, M. Dietrich¹, H. Leonards¹, A. Hoffmann¹, M. Wehner¹, E. Bremus-Köbberling¹

¹Fraunhofer ILT, Aachen, Deutschland

Introduction:

Surgeries in the abdominal wall often cause hernias, which lead to subsequent surgeries. Today those hernias will be repaired by the use of supporting meshes. Those meshes have to fulfil several demands; they have to be stable, biocompatible and have to be incorporated reliably into the abdominal tissue. On the other hand they must not adhere to the inner organs, to prevent pain and further surgical intervention[1]. The current study investigates two promising materials useful as hernia meshes, Polycaprolactone (PCL) and silk from the silk worm. Both materials can be produced as fibers and as flat films. Fibers and films are used as a composite. Each site of the composite is functionalized with bioactive molecules to allow a reliable ingrowth of the fibers into the abdominal wall and to prevent cell adhesion and organ ingrowth to the film. In the current stuy we just investigated the linkage of peptides as roll models, with the idea to use cell specific and more cell specific proteins in future experiments.

Materials and Methods:

A photolinker Sulfo-LC-SDA (λ= 370 nm) was used to link peptides to the membrane surface by irradiation [2]. We investigated the irradiation time and intensity for laser and UV-lamp, as well as photolinker and biomolecule concentration for optimal functionalization. For visualization of the linkage a BodiPY FL-EDA dye was coupled to the sulfo-group of the linker, followed by UV irradiation of the azid group. Fluorescence intensity was analyzed. Afterwards linkage of a peptide was investigated. First we wanted to quantifie the linkage. Therefore the amine group of a biotinylated GRGDS-peptide was linked. The quantitative analysis of RGD-linkage was done by ELISA measurement. Afterwards the effect of surface linked RGD on cell growth was investigated by cell cultivation of 3T3-Fibroblasts. Cells have been cultivated for up to two days in DMEM with and without serum. We stained the cells with phalloidin and DAPI and counted the number of cells.

Results and Discussion:

Fluorescence analysis of the linked BodiPY FL-EDA showed that the dye can be linked successfully to the silk and PCL surface. Best results can be achieved with irradiation intensities between 250-450 J/cm². The fluorescence intensity could be varied by variation of irradiation intensity. Comparable results can be obtained by irradiation with an UV-lamp. While irradiation with the lamp takes approx. two hours for optimal results, laser irradiation needs only several seconds. Following ELISA experiments with RGD and sulfo-LC-SDA demonstrate that concentrations of up to 1.2 ng/mm² GRGDS peptide can be linked to the PCL surface. Subsequent cell tests show an increase of cell adhesion and proliferation.

We could demonstrate that local modification of PCL and Silk surface is possible with UV irradiation. The density of functional groups can be influenced by irradiation density. Which will probaly allow us to generate gradient. In future studies we will investigate the linkage of proteins like TGF beta or TNF alpha to induce cell specific adhesion.

References:

[1] Eypasch, E. Zentralbl.Chir Volume 122 ed. 1997:855-858

[2]Gomes, Alexandre F.; J Mass Spectrom 45 (8), S. 892-899, 2010

Figure 1