Band 6, Heft 3 - Special Issue: Liquid Biopsy: A Step Forward in Laboratory Medicine; Issue Editors: Angel Díaz-Lagares and Wladimiro Jiménez

Epidermal growth factor receptor gene ( EGFR ) molecular testing is essential for guiding targeted therapies in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Between 15 and 40 % of patients with NSCLC carry mutations in EGFR that are sensitive to tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Due to the significant clinical benefits, identifying patients eligible for TKI therapy is crucial for optimizing treatment. While tumor tissue has been considered the gold standard for this testing, adequate material for EGFR molecular study cannot be obtained in up to 30 % of patients. In this context, circulating tumor DNA (ctDNA) analysis offers a guideline-recommended non-invasive method to detect EGFR mutations. Despite its promise, the widespread adoption of ctDNA analysis faces challenges for integration into clinical practice. This review provides a comprehensive synthesis of current knowledge on the clinical utility of EGFR molecular analysis in ctDNA, alongside its relationship with other circulating biomarkers widely implemented in clinical laboratories, such as serum tumor markers (STMs). It delves into the technical considerations, interpretation of results, and other challenges associated with ctDNA analysis, offering valuable insights into its integration into laboratory workflows.

Resumen El análisis molecular del gen receptor del factor de crecimiento epidérmico ( EGFR ) resulta fundamental a la hora de seleccionar una terapia dirigida para el carcinoma pulmonar no microcítico avanzado (CPNM). Entre el 15 % y el 40 % de los pacientes con CPNM son portadores de mutaciones en EGFR sensibles a los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI, por sus siglas en inglés). Para optimizar el tratamiento, resulta esencial poder identificar a los pacientes con mayor probabilidad de obtener un beneficio clínico de la terapia con TKI. Aunque el análisis del gen EGFR se suele realizar en tejido tumoral, no se puede obtener material suficiente que permita realizar esta prueba en hasta un 30 % de los pacientes. En este contexto, las guías de práctica clínica recomiendan realizar un análisis de ADN tumoral circulante (ctDNA, por sus siglas en inglés), como método no invasivo para la detección de mutaciones en EGFR Si bien se han obtenido resultados alentadores, el análisis de ctDNA presenta algunas limitaciones que dificultan su uso generalizado en la práctica clínica. Realizamos una revisión de los estudios realizados sobre la utilidad clínica del análisis molecular del EGFR en ctDNA. Así mismo, se analiza su relación con otros biomarcadores de uso frecuente en el laboratorio clínico, como los marcadores tumorales séricos (MTS) y se abordan algunos aspectos técnicos, o relacionados con la interpretación de resultados y otras dificultades asociadas al análisis de ctDNA, ofreciendo información valiosa para su integración en los flujos de trabajo del laboratorio.

Blood-based circulating tumor DNA (ctDNA) analysis has emerged as a highly relevant non-invasive method for molecular profiling of solid tumors, offering valuable information about the genetic landscape of cancer. Somatic mutation analysis of ctDNA is now used clinically to guide targeted therapies for advanced cancers. Recent advancements have also revealed its potential in early detection, prognosis, minimal residual disease assessment, and prediction/monitoring of therapeutic response. In recent years, significant progress has been made with the development of various PCR and NGS-based methods designed for assessing gene variants in ctDNA of patients with cancer. However, despite the transformative possibilities that ctDNA analysis presents, challenges persist. Standardization of preanalytical and analytical protocols, assay sensitivity, and the interpretation of results remain critical hurdles that need to be addressed for the widespread clinical implementation of ctDNA testing. In addition to somatic mutations, emerging studies on DNA methylation (epigenomics) and fragment size patterns (fragmentomics) in several types of biological fluids are yielding promising results as non-invasive biomarkers for effective cancer management. This review addresses the clinical applications of somatic gene variants in ctDNA, emphasizes their potential as cancer biomarkers, and highlights essential factors for successful implementation in clinical laboratories and cancer management.

Resumen El análisis de ADN tumoral circulante (ctDNA) es un método no invasivo de gran relevancia para la caracterización molecular de los tumores sólidos, que aporta información valiosa sobre el perfil genético del cáncer. Actualmente, el análisis de mutaciones somáticas del ctDNA se emplea en la clínica para la selección de terapias dirigidas en enfermedades oncológicas avanzadas. Avances recientes también han revelado su potencial en la detección precoz, el pronóstico y la evaluación de enfermedad mínima residual, así como en la predicción y el seguimiento de la respuesta a terapia. En los últimos años, se han logrado importantes avances en el desarrollo de diversos métodos basados tanto en la secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés) como en la realización de PCR para detectar variantes genéticas en el ctDNA de los pacientes oncológicos. Sin embargo, a pesar de las novedosas oportunidades que brinda el análisis de ctDNA, este aún presenta algunas limitaciones. La falta de normalización de los protocolos preanalíticos y analíticos y de la interpretación de los resultados, así como la heterogeneidad en la sensibilidad de las pruebas siguen siendo una asignatura pendiente que deberá ser abordada antes de impulsar un uso generalizado de las pruebas de ctDNA en la clínica. Además de las mutaciones somáticas, se están obteniendo resultados prometedores en estudios sobre la metilación del ADN (epigenómica) y el tamaño de los fragmentos de ADN (fragmentómica) en diversos tipos de fluidos biológicos como biomarcadores no invasivos para el manejo del cáncer. En la presente revisión, se describen las aplicaciones clínicas de las variantes genéticas somáticas en el ctDNA, haciendo hincapié en los biomarcadores del cáncer, y enumerando los factores esenciales para lograr una implementación eficaz en el laboratorio clínico y en el manejo de las enfermedades oncológicas.

Introduction The BRAF V600E mutation is one of the most relevant genetic mutations in precision oncology. This variation is commonly found in several types of tumors, including melanoma, colorectal cancer, and thyroid cancer, to name a few. Liquid biopsy has emerged as a minimally-invasive screening option for this mutation. Content This review examines the molecular biology of the BRAF V600E mutation, its role in tumor progression, and its utility in the diagnosis, prognosis and treatment of specific types of tumors. In addition, the focus is also placed on liquid biopsy-based screening options and their advantages over solid biopsy. Summary Detection of this mutation through liquid biopsy offers a less invasive alternative to conventional tissue biopsies, with potential utility in guiding treatment adjustments and monitoring therapeutic response. Outlook The use of liquid biopsy for the detection of BRAF V600E is expected to widespread in clinical practice, leading to the optimization of disease monitoring and personalized treatments for cancer patients.

Resumen Introducción La mutación BRAF V600E es una de las alteraciones genéticas más relevantes en oncología de precisión, comúnmente encontrada en varios tipos de cánceres como el melanoma, el cáncer colorrectal y cáncer de tiroides entre otros. La biopsia líquida permite detectar esta mutación de manera mínimamente invasiva. Contenido Esta revisión analiza la biología molecular de la mutación BRAF V600E , su papel en la progresión tumoral, y su valor para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cánceres específicos. Además, se exploran los métodos de detección mediante biopsia líquida y sus ventajas frente a la biopsia sólida. Resumen La detección de BRAF V600E a través de biopsia líquida proporciona una alternativa menos invasiva que las biopsias tradicionales, valiosa para ajustar terapias y evaluar la respuesta al tratamiento. Perspectiva Se espera que el uso de biopsia líquida para identificar BRAF V600E continúe difundiéndose en los distintos centros de salud, optimizando así el seguimiento y tratamiento de los pacientes oncológicos con enfoques personalizados.

Objectives Efficient real-time PCR kits are commercially available for the detection of Chlamydia trachomatis (CT) genetic material, but at a price. As a result, cost-effective, sensitive and specific CT diagnostic tests are essential for resource limited countries. This study aims to describe the optimization of a loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of CT ompA DNA in urine. Methods Cost-saving modifications included using Bsm polymerase and a nucleic acid gel stain. Crude DNA extraction (method-1) involved centrifuging urine at 14,000 g for 30 min, heating the deposit at 95 °C for 5 min, and centrifuging again at 17,000  g for 1 min. To boost sensitivity, urinary inhibitors were diluted with phosphate-buffered saline washes and a larger urine volume was used (method-2). The LAMP-SYBR GOLD assay was incubated at 56 °C for 60 min, with nucleic acid gel stain color changes observed under UV light. Urine from 326 sexually transmitted diseases clinic attendees was tested with both LAMP-SYBR GOLD and real-time PCR, comparing sensitivity and specificity. Results Analytical sensitivity of the LAMP-SYBR GOLD assay was 0.8 copies per reaction volume. Compared to real-time PCR, LAMP-SYBR GOLD assay had sensitivity, specificity, positive predictive and negative predictive values of 71.4 , 99.7, 96.2, 96.7 % respectively. Five of the seven false negative results obtained with method-1 were re-tested using method-2, providing in all the cases the expected positive results. Conclusions The LAMP-SYBR GOLD assay showed a sensitivity of 71 % and a high specificity for detecting CT in urine with extraction method-1. The use of method-2 could increase this sensitivity, likely due to the removal of urine inhibitors.

Resumen Objetivos Actualmente, existen en el mercado kits de PCR en tiempo real eficaces para la detección de material genético de Chlamydia trachomatis (CT), aunque estos tienen un elevado coste. En los países con recursos limitados, resulta esencial disponer de pruebas diagnósticas económicas, con una buena sensibilidad y especifidad, para la detección de infección por C. trachomatis. El objetivo de este estudio es describir la optimización de una prueba de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para la detección de ADN del gen ompA de CT en orina. Métodos Con el fin de reducir el coste de la prueba, se aplicaron algunas modificaciones, entre las que se incluyen el empleo de la polimerasa Bsm y una tinción de gel de ácido nucleico. La extracción de ADN crudo (método-1) se realizó mediante centrifugación de la orina a 14.000  g durante 30 minutos, calentando los sedimentos a 95 °C durante cinco minutos y centrifugándolo de nuevo a 17.000  g durante un minuto. Para aumentar su sensibilidad, se realizó una dilución de inhibidores de la orina con lavados con solución salina tamponada con fosfato (método-2). El ensayo LAMP-SYBR GOLD se incubó a 56 °C durante 60 minutos, observándose cambios de color en la tinción de gel de ácido nucleico bajo luz ultravioleta. Se analizó la orina de 326 pacientes con enfermedades de transmisión sexual con LAMP-SYBR GOLD y con PCR en tiempo real, con el fin de comparar su sensibilidad y especifidad. Resultados La sensibilidad analítica del ensayo LAMP-SYBR GOLD fue de 0,8 copias por volumen de reacción. Comparado con la PCR en tiempo real, el ensayo LAMP-SYBR GOLD demostró una sensibilidad del 71,4 %, una especifidad del 99,7 %, un valor predictivo positivo del 96,2 %, y un valor predictivo negativo del 96,7 %. Cinco de los siete falsos negativos obtenidos con el método-1 se volvieron a analizar con el método-2, obteniéndose el esperado resultado positivo en todos los casos un resultado positivo en todos los casos. Conclusiones El ensayo LAMP-SYBR GOLD mostró una sensibilidad del 71 % y una elevada especifidad a la hora de detectar CT en orina mediante el método de extracción-1. La sensibilidad podría haber aumentado si se hubiera empleado el método-2, probablemente debido a la eliminación de inhibidores de la orina.

Objectives Six sigma methodology (SM) measures process performance using defects per million opportunities (DPMOs). SM has traditionally used the Westgard equation (WM), by which DPMOs are calculated indirectly. An alternative for directly calculate DPMOs is the Z-transformation method in combination with the Schmidt-Launsbyn equation. The implementation of SM in External Quality Assurance (EQA) programs is limited, which hampers their evaluation. A study was conducted to compare SM values obtained with the two equations. Materials and methods Sigma value (SV) was estimated based on data from a Type I EQA Program (SCR-EQA-SEQC ML ) using two methods: the Westgard equation, and the Z-transformation + Schmidt-Launsbyn method (S-LM). A comparison of the SVs obtained with the two methods was performed. Results SVs were calculated from 949 values provided by the EQA program. The results indicate that WM underestimates SV, as compared to S-LM, independently of whether outliers were removed (2.9) or not (1.9). This underestimation occurs as a result of treatment bias rather than imprecision. Conclusions Unlike MW, S-LM adjusts for bias, thereby preventing negative SVs. S-LM is not as influenced by outliers as MW and yields more robust SV estimates in EQA programs. This guarantees a more precise evaluation of results and classification of method/system performance.

Resumen Objetivos La métrica Sigma (SM) mide el rendimiento del proceso a través de los defectos por millón de oportunidad (DPMOs). Tradicionalmente se utiliza la ecuación de Westgard (MW), la cual no realiza una estimación directa de DPMOs. Una alternativa es la transformación Z junto con la ecuación de Schmidt-Launsbyn para el cálculo directo de DPMO. La implementación de SM en los programas de Garantía Externa de Calidad (EQA) es limitada, lo que plantea desafíos para la evaluación de dichos programas. En este trabajo se comparan los valores SM obtenidos por las dos ecuaciones. Métodos Se utilizaron datos de un programa EQA de tipo I (SCR-EQA-SEQC ML ) para estimar el valor sigma (SV) mediante dos métodos: Ecuación de Westgard y transformación Z + ecuación de Schmidt-Launsbyn (S-LM). Se compararon los resultados de ambos métodos. Resultados Se incluyeron 949 valores del programa EQA para el cálculo del SV. Seis sigma calculado por MW está subestimado con respecto al valor obtenido por S-LM, tanto con valores atípicos (2,7) como sin ellos (1,9). Esta subestimación está relacionada con el sesgo de tratamiento más que con la imprecisión. Conclusiones S-LM gestiona el sesgo, evitando SV negativos a diferencia de MW. Se ve menos afectado por datos extremos, lo que lo hace robusto para el cálculo de SV en programas EQA, garantizando una evaluación precisa de los resultados y la clasificación del rendimiento de los métodos/equipos.

Objectives The determination of urinary albumin, crucial for chronic kidney disease (CKD) diagnosis and monitoring, typically employs quantitative techniques as the gold standard. However, semi-quantitative methods such as urine reagent strips show promise as cost-effective and rapid screening tools. This study aims to evaluate the feasibility of utilizing Meditape UC-11A strips (Sysmex, Kobe, Japan) for albuminuria screening compared to quantitative assays measuring urine albumin-to-creatinine ratio (ACR). Methods We systematically analyzed 1,627 strip samples using Meditape UC-11A strips whenever quantitative urinary albumin measurement was required. We compared the ACR measured by strip test with the gold standard (quantitative method determined by Atellica, Siemens, Marburg, Germany) and calculated diagnostic indicators. Additionally, we assessed the economic implications based on test prices (€2.88 for quantitative albumin plus creatinine, and €0.93 for a Meditape UC-11A strip). Results Receiver operator characteristic (ROC) curve analysis was conducted to determine the optimal cut-off point. The concordance rate achieved using the calculated cut-off point was 90.78 %. Using the quantitative test as the gold standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) of ACR, analyzed using Meditape UC-11A, were 84.2 , 91.9, 62.7, and 97.3 %, respectively. Our findings suggest a potential saving of 81.2 % on quantitative tests during the study period, amounting to €2,291.65. Conclusions This study supports the use of Meditape UC-11A strips for detecting abnormal levels of albuminuria, thus offering a viable alternative to quantitative measurement methods. Substantial cost savings can be achieved through this approach.

Resumen Objetivos Las técnicas cuantitativas son el método de referencia más habitual en la determinación de la albúmina en orina, una pieza fundamental en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad renal crónica (ERC). Por otro lado, se han desarrollado métodos semicuantitativos, como las tiras reactivas de orina, con resultados alentadores como herramientas de cribado rápidas y eficaces y con una buena relación coste-beneficio. El objetivo de este estudio era evaluar la viabilidad de la tira reactiva de Meditape UC-11A (Sysmex, Kobe, Japón) como herramienta para detectar la albuminuria, frente a los métodos cuantitativos que determinan la relación albúmina-creatinina (ACR). Métodos Se analizaron sistemáticamente 1.627 muestras empleando las tiras Meditape UC-11A cuando se solicitaba la cuantificación de albúmina en orina. Comparamos la ACR obtenida con la tira reactiva con la obtenida con el método convencional (método cuantitativo de Atellica, Siemens, Marburg, Alemania) y calculamos los indicadores diagnósticos. Así mismo, evaluamos las implicaciones económicas de emplear las tiras, teniendo en cuenta los precios de las pruebas (2,88€ en el caso del método cuantitativo para la albúmina y la creatinina, y 0,93€ en el caso de la tira Meditape UC-11A). Resultados Se realizó un análisis de la curva ROC para determinar el valor óptimo de corte, con el que se obtuvo una tasa de concordancia del 90,78 %. Utilizando la prueba cuantitativa como método de referencia, la tira Meditape UC-11A mostró una sensibilidad y especificidad, valor predictivo positivo (VPP), y valor predictivo negativo (VPN) para ACR de 84,2 %, 91,9 %, 62,7 %, y 97,3 %, respectivamente. Estos resultados indican un ahorro potencial del 81,2 % con respecto a las pruebas cuantitativas durante el periodo de estudio, lo que hubiera supuesto un ahorro de 2291,65€. Conclusiones Los resultados obtenidos respaldan la recomendación de emplear las tiras Meditape UC-11A para la detección de niveles alterados de albuminuria, lo que supone una alternativa viable a los métodos cuantitativos, permitiendo un ahorro de costes significativo.

Objectives Disease monitoring in acute leukemia management is crucial for risk stratification and chemotherapy response assessment. Minimal residual disease (MRD) testing is the most reliable tool, measuring antigenic expression differences between leukemic cells, hematogones, and mature benign B-cells. Modulation of antigen expression during treatment under chemotherapeutic drugs may complicate MRD analysis and detection. The present study investigates immunophenotypic modulation (IM) during chemotherapy phases in children with acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), using a modified BFM protocol, and its potential implications for MRD detection. Methods The study was conducted at the Hematology Department, Indus Hospital and Health Network, Karachi. All MRD positive cases of pediatric B-ALL (1 month −16 years of age) were included, from April 2019- March 2022. MRD was done on bone marrow aspirate using 8-color flow cytometry. The data from 203 patients, who were MRD positive in bone marrow throughout the evaluation period was considered. The IM was assessed by comparative analysis of the changes in mean fluorescence intensity (MFI) of nine highly relevant antigens expressed by the leukemic cells. Results Statistically significant changes in the MFI levels of antigens were observed in leukemic blasts and mature benign B-cells. All the analyzed samples revealed IM to different extents. Our results confirm the presence of immunophenotypic changes for CD10, CD19, CD34, CD45, TdT, and CD66 during chemotherapy. Conclusions Measuring the MRD assists in monitoring the disease, however, IM of the different antigens expressed by the leukemic blasts should be considered and cautiously analyzed to prevent erroneous results.

Resumen Objetivos El seguimiento de los pacientes con leucemia aguda resulta fundamental para la adecuada estratificación del riesgo y la evaluación de la respuesta a la quimioterapia. El método de seguimiento más fiable es la detección de enfermedad mínima residual (EMR), ya que, a través de ella, se identifican diferencias de expresión de antígenos entre las células leucémicas, los hematógonos y las células B benignas maduras. La modulación de la expresión de antígenos durante el tratamiento con agentes antineoplásicos podría dificultar el análisis y detección de EMR. En el presente estudio investigamos la modulación inmunofenotípica (MI) durante las distintas fases de la quimioterapia en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda (LLA-B), mediante la aplicación de un protocolo de BFM modificado, y evaluamos sus posibles implicaciones a la hora de detectar EMR. Métodos El estudio fue llevado a cabo en el Servicio de Hematología del Hospital y Red Sanitaria Indus, en Karachi (Pakistán). Se incluyeron todos los casos con resultado positivo para EMR de LLA-B en pacientes pediátricos (1 mes -16 años de edad) entre abril de 2019 y marzo de 2022. La presencia de EMR se determinó mediante aspirado de médula ósea, utilizando citometría de flujo de ocho colores. Se incluyeron datos de 203 pacientes con resultado positivo de EMR en la médula ósea durante el periodo de evaluación. La MI se determinó realizando un análisis comparativo de los cambios observados en la intensidad media de fluorescencia (IMF) de nueve antígenos clave expresados en las células leucémicas. Resultados Se observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de IMF de los antígenos expresados en los blastos leucémicos, así como en las células B benignas maduras. Todas las muestras analizadas revelaron MI en diferentes grados. Los resultados obtenidos confirman la presencia de cambios inmunofenotípicos en CD10, CD19, CD34, CD45, TdT, y CD66 durante la quimioterapia. Conclusiones Si bien la determinación de la EMR facilita el seguimiento de la enfermedad, es necesario tener en cuenta y analizar meticulosamente la MI de los diferentes antígenos expresados en los blastos leucémicos, con el fin de evitar resultados erróneos.