Molekulare und Zelluläre Möglichkeiten in der Allergiediagnostik

Einleitung

Die Allergiediagnostik beruht auf einer ausführlichen Anamnese, Hauttests, serologischen In-vitro-Tests, Ex-vivo-Methoden und Provokationstests.

Im Rahmen der Anamnese soll die Beziehung zwischen allergieverdächtigen Beschwerden und vermuteten Auslösern herausgearbeitet werden. Um den örtlichen und zeitlichen Zusammenhang zu sichern, können Symptomfragebögen z.B. bei Medikamentenüberempfindlichkeit [1, 2] hilfreich sein. Die Familienanamnese enthält Angaben zu atopischen Erkrankungen. Zusätzliche Grunderkrankungen und die Einnahme von Medikamenten sind ebenfalls von Interesse.

Zur Anwendung an der Haut sind Tests zum Nachweis von Typ-I-Sensibilisierungen von denen bei Typ-IV-Sensibilisierungen zu unterscheiden. Zu den ersteren gehören der Prick-Test und der Intrakutan-Test, zu den letzteren der Epikutantest. Beim Prick-Test wird ein Tropfen des Allergens auf den Unterarm gegeben und die Haut mit einer Prick-Lanzette kurz angestochen („geprickt“). Nach 15 Minuten wird die Testreaktion abgelesen und der mittlere Quaddeldurchmesser dokumentiert. Bei einem unerwarteten negativen Ergebnis im Prick-Test kann zusätzlich ein Intrakutantest durchgeführt werden, bei dem die Allergenlösung in einer deutlich niedrigeren Konzentration intrakutan injiziert wird. Allerdings gibt es in Deutschland aufgrund der Priorisierung der Allergenhersteller keine kommerziellen Testlösungen mehr zu diesem Zweck.

Zur Diagnose einer Typ IV Allergie werden im Epikutantest die Allergene meist in einer Salbengrundlage (Vaseline) verdünnt in Aluminiumkammern gefüllt und verbleiben für 1-2 Tage auf der Haut. Die Testreaktionen (Ekzem) werden dann nach 48 und 72 Stunden abgelesen [3].

Die In-vitro-Diagnostik umfasst vor allem die Bestimmung allergenspezifischer Immunglobuline der Klasse E (IgE). Es stehen etablierte Testsysteme für IgE-Einzelbestimmungen (Singleplex) sowie für Multiplex-Verfahren zur Verfügung. Die früher ausschließlich Extrakt-basierte Diagnostik wurde durch die neuen Möglichkeiten der molekularen Allergologie (1. erhöhte Nachweisempfindlichkeit, 2. gesteigerte analytische Spezifität, Marker für primäre Sensibilisierungen, Indikatorfunktion für Kreuzreaktionen) deutlich erweitert und optimiert den Nachweis einer Sensibilisierung im Rahmen der Allergiediagnostik [4].

Darüber hinaus stehen für die erweiterte Allergiediagnostik zelluläre ex vivo-Tests zur Verfügung. Für Typ-I-Sensibilisierungen ist dies vor allem der Basophilen-Aktivierungstest (BAT, gelegentlich noch der Histamin- und Leukotrienfreisetzungstest, sog. CAST-ELISA), für Typ-IV-Sensibilisierungen der Lymphozyten-Transformationstest.

Für den BAT wird Blut mit Allergenen und fluoreszenzkonjugierten Antikörpern (z.B. CD193 zur Identifikation von basophilen Granulozyten im Blut, sowie CD63 zur Messung der Aktivierung) bei 37 °C aktiviert. Wird IgE auf FcεRI durch Allergenmoleküle aggregiert, werden ca. 1000 bis 10 000 CD63 Antigene an die Zelloberfläche von basophilen Granulozyten transloziert. CD63 wird anschließend auf der Zelloberfläche von basophilen Granulozyten mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Wichtig ist es, eine standardisierte Allergenkonzentrationen im BAT einzusetzen. Zelluläre Tests zum Nachweis von Typ-I-Allergien werden primär zur Spezialdiagnostik eingesetzt, wenn in der Routinediagnostik (Hauttest, sIgE-Bestimmung) Probleme auftreten. Dies kann bei der Interpretation der Fall sein, wenn z.B. im Falle einer Insektengiftallergie mit unklarer Anamnese hinsichtlich des auslösenden Insektes negative oder widersprüchliche Resultate auftreten. Darüber hinaus sind diese Tests dann hilfreich, wenn z.B. Hauttestungen bei Ekzemen oder Urticaria factitia nicht durchführbar oder auswertbar sind, das Gesamt-IgE extrem niedrig ist [5] oder seltene Allergene (z.B. bei Allergien auf Nahrungsmittel oder Medikamente) für die Bestimmung von sIgE-Antikörpern nicht zur Verfügung stehen. Weiterhin ist ihr Einsatz möglich, wenn Provokationstestungen aufgrund pharmakologischer Eigenschaften von Medikamenten, aufgrund der Schwere der anamnestisch angegebenen Reaktion oder aus ethischen Bedenken (Gefahr der Neu-Sensibilisierung) nicht durchgeführt werden können. Viele Allergene, die hierzu in Frage kommen, stehen kommerziell zur Verfügung; es können aber auch z.B. frische, native Nahrungsmittel eingesetzt werden. Auch sollen diese Tests in gewissem Rahmen die Bewertung der klinischen Relevanz einer Allergie und Überwachung der Allergietherapie erleichtern (siehe Abschnitt 5).

Bei schweren arzneimittel-induzierten Hautreaktionen wie dem Stevens-Johnson-Syndrom und der Toxischen epidermalen Nekrolyse können Epikutantestungen diagnostisch hilfreich sein [6]. Es kann weiterhin versucht werden, das relevante T-Zell Antigen mit einem Lymphozytentransformationstest zu identifizieren. Die Ausschöpfung aller risikolosen diagnostischen Methoden ist insbesondere bei den schweren bullösen Arzneireaktionen wichtig, weil ein Provokationstest hier kontraindiziert ist. Im LTT werden mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut isoliert und mehrere Tage mit Allergenen kultiviert. Die einsetzende Proliferationsantwort der das Antigen erkennenden Lymphozyten wird als Ausdruck der Sensibilisierung gemessen. Als Messparameter dient meist der Einbau von Tritium-markiertem Thymidin (3H-Thymidin), wobei ein Stimulationsindex (inkorporierte Radioaktivität in der unstimulierten Kultur : Allergen-stimulierten Kultur) als Ergebnis angegeben wird. Für die Ergebnisbewertung müssen Kontrollen eingeschlossen werden und das klinische Bild der vermuteten Spättyp-Allergie einbezogen werden [7].

Provokationstests mit den vermuteten Auslösern bzw. mit Ausweichpräparaten werden als Goldstandard der Allergiediagnostik angesehen. Mit Inhalationsallergenen können sie ambulant an der Schleimhaut (Augen, Nase) durchgeführt werden. Provokationen mit Medikamenten und Nahrungsmittel erfordern bei potentiell bedrohlichen Systemreaktionen meist einen stationären Aufenthalt unter Notfallbereitschaft. Darüber hinaus kann 6 – 12 Monate nach Beginn einer spezifischen Immuntherapie eine Insektengiftstichprovokation durchgeführt werden, die in Deutschland nur in ganz wenigen Spezialzentren möglich ist [3].

Molekulare und Zelluläre Algorithmen zur Allergiediagnostik

Wird bei einem Patienten eine IgE-vermittelte allergische Erkrankung vermutet, beginnt die Allergiediagnostik mit Erhebung der Krankengeschichte sowie einer körperlichen Untersuchung (Abbildung 1). Die Anamnese liefert wichtige Hinweise für oder gegen das Vorliegen eines allergischen Zusammenhangs bzw. auf mögliche Auslöser.

Abbildung 1:

Der neue diagnostische Algorithmus (aus [8]).

Saisonal auftretende Symptome einer Rhinokonjunktivitis lassen sich z.B. folgenden Allergenquellen zuordnen:

• Feb bis April: Baumpollen (Birke, Hasel, Erle, Buche, Eiche, seltener Esche)

• Mitte Mai bis Juli: Gräserpollen (incl. Roggen)

• Juli-August: Schimmelpilz Alternaria oder Kräuterpollen (Beifuß).

Ganzjährige allergische Symptome beruhen häufig auf Hausstaubmilben oder Tierbestandteilen.

Auch wenn die genaue Ursache der allergischen Symptome anamnestisch schwer einzugrenzen ist, sollte in jedem Fall eine Sensibilisierung auf häufige Allergenquellen geprüft werden [9]. Dies kann mit Hilfe von Allergenextrakten über einen direkten serologischen Nachweis, oder aber indirekt in-vivo durch Hauttests bzw. in begründeten Fällen ex-vivo durch einen Basophilenaktivierungstest erfolgen. Die Testreihenfolge ergibt sich aus der Verfügbarkeit der Methoden; meist werden Hauttests (z.B. Pricktests) vor Labortests durchgeführt. Die mittels Extrakt-basierter Diagnostik gewonnenen Ergebnisse sollten gewissenhaft auf ihre klinische Relevanz überprüft werden. Im Falle einer Nicht-Übereinstimmung zwischen positiver Anamnese, Untersuchung und negativen serologischen Testergebnissen kann ein Basophilenaktivierungstest hilfreich sein. Er ist analytisch extrem empfindlich, beruht auf zellulär gebundenen IgE-Antikörpern und spiegelt deren funktionelle Aktivität wider [10]. Dies ist insbesondere in Fällen sehr geringer Antikörperkonzentration (niedriges Gesamt-IgE <10 kU/L) von Vorteil, bei denen das spezifische IgE unterhalb der Nachweisgrenze (<0,1 kU_A/L) liegt.

Ist eine klinisch bedeutsame Sensibilisierung gegen einen Allergenextrakt identifiziert worden, kann die IgE-Bestimmung gegen spezifische Allergenmoleküle im Singleplex- oder Multiplexverfahren [11] potentielle Kreuzreaktionen enttarnen und Risikoprofile für schwere Reaktionen aufzeigen [8]. So markiert die Sensibilisierung gegenüber den stabilen Erdnuss-Speicherproteinen (vor allem Ara h 2, aber auch Ara h 1, 3, 6) ein erhöhtes Risiko für anaphylaktische Reaktionen, während der IgE-Nachweis gegen das Erdnuss-Protein Ara h 8, strukturverwandt mit dem labilen Hauptallergen der Birkenpollen (Bet v 1), bestenfalls mit milden oralen Symptomen assoziiert ist. Die Relevanz einer quantitative Bestimmung der IgE-Antikörper gegen Moleküle ist letztlich individuell bei jedem Patienten im Rahmen der Ergebnisinterpretation zu klären.

Die funktionelle Aktivität des IgE, auch sehr geringer Konzentrationen, lässt sich in einem zellulären Basophilenaktivierungstest darstellen [12]. Inwieweit letzterer besser als Haut- oder IgE-Tests die klinische Relevanz einer Sensibilisierung widerspiegelt, ist derzeit Gegenstand der wissenschaftlichen Diskussion. Nach wie vor gilt die In-vivo-Provokation als Goldstandard zur Sicherung einer klinischen Diagnose [13]. Hierzu werden Allergenextrakte oder natürliche Allergene auf die Schleimhaut gegeben (Konjunktiven, Nasenschleimhaut) oder in steigenden Konzentrationen oral verabreicht. So kann beispielsweise bei positiver Provokation eine in 5% der saisonalen Allergiker vermutete, lokal begrenzte allergische Rhinitis gegenüber aerogenen Allergenen identifiziert werden, bei der Haut- und IgE-Test negativ ausfallen. Insbesondere im Bereich der Nahrungsmittelallergien repräsentiert die doppelblinde Placebo-kontrollierte Provokation nach wie vor den diagnostischen Goldstandard, da nur sie das klinische Risiko verlässlich widerspiegelt. Es gibt Hinweise darauf, dass Parameter des BAT eine Einschätzung hinsichtlich der klinischen Reaktivität erlauben, sodass es in Zukunft möglich sein könnte, weniger Provokationstests durchführen zu müssen. Letztlich müssen keinesfalls alle Patienten die komplette Liste diagnostischer Optionen durchlaufen, sondern jeder diagnostische Test trägt einzeln zur Wahrscheinlichkeit der korrekten Allergiediagnose bei [12]. Eine umfangreiche Monographie (EAACI Molecular Allergology User´s Guide) [8] bietet spezifische diagnostische Algorithmen für die wichtigsten bekannten Einzelallergene.

Klassische Allergologie und neue molekulare allergologische Möglichkeiten

Zelluläre Möglichkeiten zur Bewertung der klinischen Relevanz einer Allergie und Überwachung der Allergietherapie

Zur spezifischen Allergiediagnostik von Typ-I-Allergien können zelluläre ex-vivo-Testsysteme eingesetzt werden, die vorwiegend auf dem indirekten Sensibilisierungsnachweis von basophilen Granulozyten (aufgrund ihrer leichteren Verfügbarkeit im Blut gegenüber Mastzellen im Gewebe) beruhen [7]. Sie nutzen den Nachweis von Mediatoren oder zellulären Antigenen, die bei erfolgreicher Aktivierung messbar sind. Angereicherte Blutleukozyten oder Vollblut werden mit Allergenen oder anderen Auslösern inkubiert. Die nach Allergenstimulation exprimierten Oberflächenmarker bzw. die freigesetzten Mediatoren der basophilen Granulozyten dienen als indirektes Maß für zellulär gebundenes spezifisches IgE, das dem IgE im Plasma entspricht.

Sie werden zur Diagnostik eingesetzt, wenn bei den konventionellen Allergietests Probleme auftreten, sei es bei der Interpretation (z.B. bei widersprüchlichen Resultaten) oder Durchführung, wenn z.B. Hauttestungen bei Ekzemen oder Urticaria factitia nicht durchführbar oder auswertbar sind oder im Falle von seltenen Allergenen (z. B. Medikamenten) die Bestimmung sIgE-Antikörper nicht zur Verfügung steht [10]. Darüber hinaus ist ihr Einsatz möglich, wenn Provokationstestungen aufgrund pharmakologischer Eigenschaften von Medikamenten, aufgrund der Schwere der anamnestisch angegebenen Reaktion oder aus ethischen Bedenken (Gefahr der Neu-Sensibilisierung) nicht durchgeführt werden.

Neben diesen Einsatzfeldern gibt es Hinweise dafür, dass es insbesondere mittels des Basophilen-Aktivierungstests (BAT) möglich ist, zum einen klinisch manifeste Allergien von reinen Sensibilisierungen zu unterscheiden und zum anderen das Ansprechen von Therapien (spezifische Immuntherapie, Therapie mit Omalizumab) zu überprüfen. Während es bei der Diagnostik vorrangig um eine Aktivierung der Zellen (Angaben in % Aktivierung) durch das Allergen jenseits eines definierten Cut-offs geht („Basophilenreaktivität“), müssen zur differenzierteren Betrachtung Dosis-Wirkungskurven mit mindestens 6-8 Konzentrationen des Allergens erstellt werden, aus denen man die sog. „Basophilensensitivität“ ablesen kann (Berechnung von EC50 oder CD-sens, Abbildung 2). Hierbei wird die EC50 bestimmt, also diejenige Allergenkonzentration, auf die 50% der Basophilen antworten. Aus diesem Wert kann die CD-sens berechnet werden, indem der reziproke Wert mit 100 multipliziert wird [10].

Abbildung 2:

(A) Ableitung der Basophilenreaktivität (Höhe der maximalen Aktivierung) und der Basophilensensitivität (EC50 bzw CD-sens, =Allergenkonzentration zur halbmaximalen Stimulation). (B) Eine Änderung der Sensitivität kann auch mit wenigen Allergenkonzentrationen nachgewiesen werden (aus [10]).

Im Bereich der Insektengiftallergie konnte zwischen der Höhe der Basophilenaktivierung und der Schwere der anamnestisch angegebenen Stichreaktion allerdings keine Korrelation gefunden werden. Das Auftreten von Nebenwirkungen während der spezifische Immuntherapie wurde von einigen Autoren mit Relationen von konzentrationsabhängigen Werten beim BAT in Zusammenhang gebracht; andere konnten dies nicht zeigen. Der Erfolg der spezifischen Immuntherapie spiegelt sich erst nach mehrjähriger Therapie mit signifikant reduzierter Aktivierung bei submaximalen Stimulationsbedingungen wider. Dies konnte auch in Gruppen, bei denen mittels Stichprovokation am Ende der Immuntherapie der Erfolg überprüft wurde, gezeigt werden [20, 21].

Auch bei den Inhalationsallergien gibt es Daten, dass es zu einer Reduktion der Basophilenantwort nach mehrjähriger spezifischer Immuntherapie kommt [22]. Darüber hinaus konnte der therapeutische Effekt von Omalizumab mittels des BAT überprüft werden [23, 24]. Bis zu einem gewissen Grad kann der BAT bei Nahrungsmittelallergien möglicherweise dazu beitragen zwischen einer asymptomatischen Sensibilisierung und einer klinisch relevanten Allergie zu unterscheiden. Dies wurde für die Erdnuss-, Ei- und Milchallergie bei Kindern sowie bei Haselnuss-sensibilisierten und -allergischen Individuen in Pilotstudien gezeigt. Für Kinder schien der BAT darüber hinaus zusammen mit anderen Parametern (sIgE, Prick-Test) eindeutige Hinweise zu geben, zu welchem Zeitpunkt eine orale Provokationstestung mit Ei oder Milch erfolgen sollte, um schwere klinische Reaktionen zu vermeiden. Bei Immuntherapien, z.B. mit Erdnüssen, konnte eine signifikante Abnahme der Aktivierung im BAT nachgewiesen werden [12, 25]. Sofortreaktionen im Rahmen von rasch gesteigerten Desensibilisierungsprotokollen bei Allergien auf Chemotherapeutika (z.B. Platinkomponenten) gingen mit positiven Ergebnisse im BAT und erhöhten Tryptasewerten einher.

Die vorgestellten Daten beruhen vorwiegend auf dem Vergleich von Gruppen und sind für eine individuelle Vorhersage bisher noch nicht ausreichend. Im Einzelfall muss daher das Ergebnis des BAT im Hinblick auf die klinische Relevanz oder den Erfolg einer Therapie immer kritisch hinterfragt und in Zusammenschau von Anamnese und den Resultaten anderer Typ-I-Allergietests bewertet werden.

Perspektiven der Allergiediagnostik

Quantitative Bestimmungen des spezifischen IgE mit Methoden verschiedener Diagnostikahersteller sind leider schlecht vergleichbar. In deutschen Ringversuchen werden daher spezifische IgE-Resultate herstellerabhängig ausgewertet; sie zeigen darüberhinaus zwischen den durchführenden Labors je nach Methode erhebliche Abweichungen [26]. Für Basophilen-Aktivierungstests sind externe Ringversuche geplant - bei INSTAND e.V. für deutsche Labors, und durch die EAACI für europäische und eventuell weltweite Interessenten.

Der Hauttest (Pricktest) ist in Deutschland und den meisten anderen Ländern der Europäischen Union auf Grund seiner Verbreitung, der leichten Durchführung und dem kurzen Zeitbedarf der häufigste Allergietest (Cardona et al, in Vorbereitung). Durch die hohen Zulassungsanforderungen der EU an In-vivo-Testallergene und die Rücknahme vieler Testallergene vom Markt, wird die Allergiediagnostik derzeit erschwert. Da bei dem Hauttest Allergene in den Körper eingebracht werden, betrachtet man die dazu verwendeten Allergenpräparate seit der EU Direktive 89/342/ECC bzw. 2001/83/EC als Arzneimittel, und unterwirft sie den gleichen Produktions- und Zulassungsbedingungen wie therapeutische Allergene und andere Medikamente. In Deutschland gewährleistet das Paul-Ehrlich-Institut als zuständige Bundesbehörde die Umsetzung der EU-Direktiven. Im Zeitraum 2004 bis 2012 sind fast 50% der registrierten Hauttestallergene (insbesondere für den Intrakutantest) vom Markt genommen worden [27, 28]. In den 70er Jahren forderte der Allergologe Jack Pepys am Brompton Hospital in London, dass der Patient die vermeintlichen Allergieauslöser für die Diagnostik selbst mitbringen sollte. Obwohl dieses bei manchen Nahrungsmitteln tatsächlich noch notwendig ist, weil entweder die fraglichen Allergenquellen für die klinische Diagnostik nicht kommerziell zur Verfügung stehen, oder weil nur ein frisches, natives (zugegebenermaßen nicht-standardisiertes) Allergen die wirklich relevanten Allergene in ausreichender Menge und Stabilität enthält, sind heute viele Allergene als standardisierte Produkte verfügbar. Die Forderungen der Deutschen und Europäischen Behörden an die Hersteller sollten diese Entwicklung unterstützen.

Etwa 15% der deutschen Bevölkerung haben eine klinisch manifeste allergische Rhinitis und weitere 7% ein klinisch manifestes allergisches Asthma [29]. Eine zuverlässige Allergiediagnostik ist daher von erheblicher Bedeutung. Da derzeit zunehmend weniger diagnostische Allergene für Haut- und Provokationstestungen zur Verfügung stehen, werden zukünftig in-vitro/ex-vivo-Testverfahren wie die molekulare Allergiediagnostik und die zelluläre in-vitro/ex-vivo-Allergiediagnostik wahrscheinlich eine immer größere Bedeutung bekommen.