Labordiagnostik bei systemischen Autoimmunerkrankungen

Anti-zelluläre Antikörper der ANA (Antinukleäre Antikörper)-Familie

Als prototypische Autoantikörper werden die antinukleären Antikörper (ANA) seit der Erstbeschreibung vor ca. 60 Jahren im Rahmen der diagnostischen Abklärung von systemischen Autoimmunerkrankungen häufig untersucht, wobei eine besondere Assoziation zu den Kollagenosen besteht. Zu den Kollagenosen werden der systemische Lupus erythematodes (SLE), die systemische Sklerose, das Sjögren-Syndrom, die Poly-/Dermatomyositis sowie das Sharp-Syndrom gerechnet.

Allerdings finden sich ANA bei den verschiedenen Kollagenosen mit unterschiedlicher Häufigkeit und können auch bei anderen Erkrankungen festgestellt werden (z.B. juvenile idiopathische Arthritis, Autoimmunhepatitis). Zudem können ANA häufig schon viele Jahre vor der Manifestation einer Kollagenose und auch bei Gesunden nachgewiesen werden. ANA können auch medikamenteninduziert und im Rahmen von Infektionen auftreten. Der positive prädiktive Wert für eine manifeste systemische Autoimmunerkrankung ist deshalb bei einem zufällig nachgewiesenen ANA-Titer äußerst gering (<5%), weshalb die ANA-Diagnostik nur gezielt bei entsprechender Verdachtsdiagnose durchgeführt werden sollte. Als Goldstandard für den Nachweis von ANA gilt der indirekte Immunfluoreszenztest (IFT) unter Verwendung der HEp-2-Zelllinie und deren Varianten, der als Screeninguntersuchung eingesetzt wird. Mit dieser Methode werden allerdings nicht nur gegen den Zellkern gerichtete Autoantikörper detektiert, sondern auch Autoantikörper nachgewiesen, die andere zelluläre Strukturen erkennen. Vor diesem Hintergrund laufen Bestrebungen, den Begriff der „ANA“ durch die neue Bezeichnung „anti-zelluläre Antikörper der ANA-Familie“ zu ersetzen [6].

Bei dem IFT können verschiedene Muster abgegrenzt werden, die auf das erkannte Autoantigen hinweisen. Die genaue Differenzierung der ANA-Spezifität erfolgt allerdings in einem zweistufigen Nachweisverfahren durch den Einsatz von Immunoassays, die an einen positiven ANA-IFT angeschlossen werden. Die Häufigkeit der wichtigsten spezifischen Autoantikörper und die Assoziation mit einzelnen Kollagenosen bzw. Krankheitsbildern sind in Tabelle 1 dargestellt. Auf Grund der Komplexität möglicher Antikörperkombinationen bei verschiedenen Krankheitsbildern und der oft geringen Sensitivität und stark variierenden Spezifität einzelner Autoantikörper kann die Diagnose allerdings erst nach der Gesamtschau aller Laborergebnisse zusammen mit der Anamnese und den klinischen Befunden erstellt werden [1].

Internationale Empfehlungen zur ANA-Diagnostik

Zahlreiche Institute verwenden inzwischen neue Immunoassays als ANA-Screening-Methode anstelle des herkömmlichen IFT, da hierdurch eine größere Anzahl von Patientenproben schneller und einfacher bearbeitet werden kann. Allerdings besitzen die bisher verfügbaren Immunoassays ein sehr limitiertes Autoantigenspektrum (in der Regel bis zu 10 Autoantigene), während die HEp-2-Zelle eine deutlich größere Anzahl nukleärer und zellulärer Autoantigene enthält (ca. 100–150 Autoantigene). Vor diesem Hintergrund wurde in einem aktuellen Positionspapier des American College of Rheumatology (ACR) der IFT unter Verwendung der HEp-2-Zelllinie weiterhin als Goldstandard für das ANA-Screening empfohlen [7]. Da sich die verschiedenen ANA-Nachweisverfahren erheblich in der Methodik, den detektierten Autoantikörperprofilen sowie Sensitivität und Spezifität unterscheiden, bestehen Unsicherheiten bezüglich der Standardisierung sowie der Interpretation inkongruenter Untersuchungsbefunde [1, 8].

In einer internationalen Expertengruppe wurden daher Empfehlungen für den ANA-Nachweis und die Interpretation der Testergebnisse erarbeitet, wobei ein zweistufiges Verfahren vorgeschlagen wurde: Der IFT wird dabei als Referenzmethode für das ANA-Screening eingeordnet und soll bei positivem Befund (1:160) durch spezifische Immunoassays zur Differenzierung der Autoantikörperspezifität ergänzt werden. Im Befund sollte das Nachweisverfahren, die höchste positive Titerstufe sowie das nukleäre sowie ggf. das zytoplasmatische Muster gemäß standardisierter Terminologie enthalten sein. Bei V.a. einen SLE bzw. das Vorliegen von anti-dsDNA-AK sollte der Farr-Assay oder der Chritidia luciliae IFT ergänzend durchgeführt werden, da diese Methoden die höchste Spezifität aufweisen. In den Empfehlungen wird zudem besonders das Auftreten inkongruenter Testergebnisse berücksichtigt, weshalb in diesem Fall die Anwendung eines anderen etablierten Nachweisverfahrens erwogen und auf einen engen Austausch zwischen Klinikern und Labormedizinern geachtet werden sollte [6, 9].

Automatisierte ANA-IFT-Analyse-Systeme

Der IFT als Referenzmethode für das ANA-Screening weist zahlreiche Nachteile auf: Die Methode ist aufwendig, wenig automatisiert und standardisiert und erfordert die Beurteilung durch einen erfahrenen Experten, der den Befund nach der eigenen subjektiven Einschätzung erstellt und ist deshalb besonders fehleranfällig. Vor diesem Hintergrund wurden von verschiedenen Herstellern automatisierte ANA-IFT-Analyse-Systeme entwickelt, welche den Arbeitsaufwand um bis zu 24% verringern können [10]. Die Systeme zeichnen sich bereits durch eine gute Diskrimination zwischen positiven und negativen ANA-Befunden aus, was sich in einer Sensitivität von 96,7% und einer Spezifität von 89,2% ausdrückt. Zudem besteht auch eine gute Korrelation der Signalintensität mit den klassisch bestimmten Titerstufen (Spearman’s rho: 0,672 –0,839; p<0,0001 für alle Systeme). Eine automatisierte Mustererkennung kann bereits durch einige Systeme durchgeführt werden, zeigt allerdings noch eine geringe Übereinstimmung mit der manuellen Auswertung (52%–79%) [11].

ACR/EULAR 2013 Klassifikationskriterien für die systemische Sklerose

Bei bis zu 50% der Patienten mit manifesten systemischen Autoimmunerkrankungen kann innerhalb der ersten 12 Monate keine definitive Diagnose gestellt werden, weshalb in diesen Fällen häufig von undifferenzierten Erkrankungen, z.B. einer undifferenzierten Arthritis oder undifferenzierten Kollagenose gesprochen wird [1]. Vor diesem Hintergrund und den wesentlich erweiterten therapeutischen Optionen wurden in den letzten Jahren besondere Anstrengungen unternommen, neue Kriterien für die Diagnose bzw. Klassifikation von systemischen Autoimmunerkrankungen zu entwickeln, die eine frühzeitigere Diagnosestellung und Einordnung erlauben. Hierbei finden Autoantikörper eine besondere Berücksichtigung, die als charakteristische Marker für Autoimmunität neben diagnostischer und prognostischer Bedeutung teilweise auch eine pathophysiologische Relevanz besitzen. Aufgrund der Unzulänglichkeiten bisheriger Klassifikationskriterien wurden aktuell neue Klassifikationskriterien für die SSc im Rahmen einer EULAR/ACR-Initiative entwickelt und inzwischen publiziert (siehe Tabelle 2). Neben der Hautbeteiligung und klinischen Befunden werden in diesen neuen Klassifikationskriterien jetzt auch Autoantikörperbefunde und die Ergebnisse der Kapillarmikroskopie berücksichtigt. In das neue Klassifikationssystem wurden folgende SSc-assoziierten Autoantikörper aufgenommen: Anti-Centromer-AK, anti-Topoisomerase I [anti-Scl-70]-AK und anti-RNA Polymerase III-AK, die bei entsprechendem klinischen Verdacht bestimmt werden sollten [12].

Aktuelle Chapel Hill Konsensus Nomenklatur der Vaskulitiden

Basierend auf den Ergebnissen einer erneuten Konsensuskonferenz im Jahr 2011 wurde die Chapel Hill-Nomenklatur der Vaskulitiden grundlegend überarbeitet und inzwischen publiziert (siehe auch Abbildung 1) [13]. Dem allgemeinen Trend folgend bei Krankheitsbezeichnungen Eponyme zu verlassen, wurden auch in der neuen Chapel Hill-Nomenklatur vertraute Krankheitsbezeichnungen durch neue Namen ersetzt. So wird die Wegnersche Granulomatose jetzt als „Granulomatose mit Polyangiitis“ (GPA) bezeichnet. In Analogie zu dieser am pathologischen Befund orientierten Namensgebung wird beispielsweise das Churg-Strauss-Syndrom jetzt als „Eosinophile Granulomatose mit Polyangiitis (EGPA)“ benannt. Für andere Entitäten wie die Takayasu Arteriitis und die Kawasaki-Erkrankung wurden dagegen die bekannten Eponyme noch beibehalten. Die Einteilung der Vaskulitiden untereinander umfasst nun sieben unterschiedliche Kategorien. Neu sind u.a. die Abgrenzung von Vaskulitiden einzelner Organe (z.B. die primäre cerebrale Vaskulitis oder die isolierten Vaskulitiden) in einer gemeinsamen Gruppe, als auch die Unterscheidung separater Kategorien für die sekundären Vaskulitiden im Rahmen von Systemerkrankungen (z.B. Rheumatoide Vaskulitis) und anderer bekannter Ätiologie (z.B. durch Infektionen oder Medikamente induziert). Eine wesentliche Änderung betrifft die Kleingefäßvaskulitiden. Hier werden jetzt auch in der Chapel Hill-Klassifikation die Mikroskopische Polyangiitis, GPA und EGPA unter dem Überbegriff „ANCA-assoziierte Vaskulitiden (AAV)“ zusammengefasst und von den Immunkomplexvaskulitiden abgegrenzt. Bei den Immunkomplexvaskulitiden kleiner Gefäße werden nun auch die anti-GBM-Krankheit (früher Goodpasture Syndrom) und die früher als Henoch-Schönlein-Purpura bezeichnete IgA-Vaskulitis geführt. Die Krankheitsdefinitionen der Chapel Hill-Nomenklatur leiten sich vor allem von der zugrunde liegenden Pathologie (Gefäßgröße, Zusammensetzung des entzündlichen Infiltrats etc.) und der Pathogenese (z.B. Antikörper-assoziiert, immunkomplex-vermittelt, infekt-bedingt etc.) ab und beziehen nur zum Teil charakteristische klinische Merkmale ein. Die Chapel Hill-Nomenklatur ersetzt somit keine Klassifikationskriterien, wie die derzeit immer noch gültigen ACR-Klassifikationskriterien der Vaskulitiden.

Abbildung 1:

Verteilungsmuster der Vaskulitiden nach der neuen Nomenklatur.

Modifiziert nach [13].

Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA)

Ähnlich wie die ANA wird auch für den die ANCA-Diagnostik die Kombination von IFT (Screeningtest) mit Immunoassays zum Nachweis der spezifischen Antikörper gegen Proteinase-3 (PR3) und Myeloperoxidase (MPO) empfohlen. Es werden c-ANCA (zytoplasmatisches Muster), p-ANCA (perinukleäres Muster) und x-ANCA (atypisches Muster) unterschieden, wobei das Bindungsverhalten der Antikörper auf äthanol- und formalinfixierten Granulozyten untersucht wird. Hierbei zeigen anti-PR3-AK im IFT zu über 90% ein c-ANCA- und nur selten ein p-ANCA-Muster, während anti-MPO-AK dagegen meist ein p-ANCA-Muster (ca. 90%) und nur selten ein c-ANCA Muster aufweisen. Es sollte unbedingt jeder positive oder unklare IFT-Befund durch die zur Verfügung stehenden spezifischen Immunoassays weiter abgeklärt werden, oder beide Untersuchungsverfahren primär parallel angesetzt werden. X-ANCA reagieren weder gegen PR3 noch gegen MPO und sind nicht mit Vaskulitiden assoziiert. Sie finden sich häufig bei Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa, primär sklerosierender Cholangitis oder Autoimmunhepatitis und selten bei M. Crohn, RA oder Kollagenosen [14, 15].

Bei V.a. das Vorliegen einer ANCA-assoziierten Vaskulitis (AAV) und insbesondere dem pulmorenalen Syndrom ist eine rasche Bestimmung von ANCA und anti-glomerulären Basalmembran-Antikörpern (anti-GBM-AK) von besonderer diagnostischer Bedeutung. Häufig werden diese Autoantikörper jedoch nur im Rahmen der Routinediagnostik bestimmt und stehen nicht als Notfallparameter zur Verfügung, was die Diagnosestellung insbesondere bei kritisch kranken Patienten entscheidend verzögern kann. In einer Studie wurde deshalb die Genauigkeit von Schnelltests (Dotblot-Verfahren, Testergebnis innerhalb von 2 Stunden verfügbar) für die Bestimmung von anti-PR3-AK, anti-MPO-AK und anti-GBM-AK mit den diagnostischen Standardverfahren (IFT und ELISA) bei 260 konsekutiven Patienten mit V.a. AAV untersucht [16]. Bei insgesamt 74 Patienten konnte in dieser Studie die Diagnose einer AAV (n=62) oder anti-GBM-Erkrankung (n=12) gestellt werden. Sowohl im Dotblot, als auch im ELISA wurden alle 12 Fälle mit anti-GBM-Erkrankung sicher identifiziert, bei 2 falsch positiven Ergebnissen. Der Dotblot-Schnelltest zeigte bei 56 von 62 AAV-Patienten einen positiven ANCA-Befund (Sensitivität 90%, NPV 97%) bei 5 falsch positiven Befunden (Spezifität 97%, PPV 90%). Der eingesetzte Phadia ELiA anti-PR3s oder anti-MPOs war bei 57 der 62 AAV Patienten positiv (Sensitivität 92%, NPV 97%) und zeigte 5 falsch positive Befunde (Spezifität 97%, PPV 88%). Der Routine-ELISA ergab ähnliche Ergebnisse (Sensitivität 94%, Spezifität 97%, PPV 88%, NPV 98%) [16].

Es konnte also eine hervorragende Übereinstimmung der Ergebnisse des Dotblot-Schnelltests für anti-GBM-AK, anti-PR3-AK und anti-MPO-AK mit den etablierten Routineverfahren demonstriert werden. Bei entsprechendem klinischem Verdacht könnte durch den Einsatz dieser Schnelltestverfahren insbesondere auf Intensivstationen möglicherweise eine frühzeitigere Diagnosestellung bei kritisch kranken Vaskulitispatienten ermöglicht werden.

Anti-Ferritin-Antikörper bei Polymyalgia rheumatica und Riesenzellarteriitis

Aufgrund der fehlenden Biomarker ist die Diagnosestellung bei der Polymyalgia rheumatica (PMR) und Riesenzellarteriitis (GCA) häufig erschwert. Vor diesem Hintergrund wurde von einer Arbeitsgruppe durch den Einsatz von Protein-Arrays nach neuen Autoantikörpern bei diesen Patienten gesucht [17]. Durch diese Methodik konnten erstmals Autoantikörper gegen 27 N-terminale Aminosäuren (19–45) der schweren Kette des humanen Ferritinproteins bei PMR- und GCA-Patienten nachgewiesen werden. Um den Stellenwert dieser Autoantikörper als neuer Biomarker zu analysieren, wurden Seren von PMR- und GCA-Patienten mittels ELISA auf das Vorhandensein von anti-Ferritin-AK untersucht. Es zeigte sich ein positiver anti-Ferritin-AK Nachweis bei 92% der unbehandelten PMR- und GCA-Patienten sowie bei 69% der PMR- und GCA-Patienten mit akutem Krankheitsschub. Dagegen waren anti-Ferritin-AK nur bei 29% der SLE-, 3% der RA-, 6,5% der NHL- und 1% der gesunden Blutspender festzustellen, die als Kontrollen untersucht wurden [17]. Diese sehr guten Ergebnisse wurden allerdings durch eine andere Studie inzwischen relativiert, die lediglich bei 72% der GCA-Patienten mit histologisch gesicherter Diagnose anti-Ferritin-AK nachweisen konnte. Zudem waren nur bei 41,3% der GCA-Patienten mit negativem Histologiebefund anti-Ferritin-AK festzustellen, was im Bereich der Kontrollpatienten mit anderer Diagnose lag (31,9%). Allerdings konnten auch in dieser Studie nur bei 2,5% der gesunden Probanden anti-Ferritin-AK detektiert werden [18]. Der Stellenwert der Autoantikörper gegen die schwere Kette des humanen Ferritinproteins bleibt also weiter unklar und muss in weiteren Studien evaluiert werden.

Anti-carbamylierte Protein (anti-CarP) Antikörper als neuer Biomarker

Neben dem Rheumafaktor (RF) werden in den aktuellen ACR/EULAR-Klassifikationskriterien für die rheumatoide Arthritis (RA) von 2010 auch die anti-citrullinierten Protein/Peptid-Antikörper (ACPA) als Kriterium berücksichtigt [19]. Sowohl RF als auch ACPA können bereits viele Jahre vor der Manifestation der RA nachgewiesen werden, wobei jedoch ca. 20% der RA-Patienten keinen dieser Autoantikörper entwickeln („seronegative“ RA). Vor diesem Hintergrund werden weitere Biomarker benötigt, die eine frühzeitigere und sichere Diagnosestellung erlauben und idealerweise auch pathophysiologische Relevanz besitzen. Ein solcher neuer Biomarker könnten möglicherweise Autoantikörper gegen carbamylierte Proteine (anti-CarP) sein, die bei einem Teil der RF und ACPA negativen RA-Patienten bereits mehrere Jahre vor der Manifestation der RA im Serum detektiert werden konnten [20]. Die Carbamylierung ist eine posttranslationale Modifikation, bei der Lysin in Homocitrullin umgewandelt wird. In dieser Studie wurden sequentielle Serumproben von 79 RA-Patienten analysiert, die vor der Manifestation der RA regelmäßig Blutspenden durchgeführt hatten. Bei ca. einem Drittel dieser RA-Patienten konnten unter Verwendung von 2 verschiedenen Antigensystemen anti-CarP-Antikörper nachgewiesen werden, wobei 5 der 79 untersuchten RA-Patienten bei negativen Befunden für ACPA und RF ausschließlich für anti-CarP-Antikörper positiv getestet wurden (Abbildung 2).

Abbildung 2:

Verteilungsmuster von ACPA, IgM-RF und anti-CarP-Antikörper bei 79 RA-Patienten.

Modifiziert nach [20].

Anti-Drug-Antikörper (ADAb)

Die Biologika haben die therapeutischen Optionen bei der RA wesentlich erweitert. Insbesondere die TNF-Inhibitoren haben sich bei der Behandlung zahlreicher verschiedener chronisch entzündlicher Erkrankungen als wirksam erwiesen. Allerdings sprechen mehr als ein Drittel der Patienten nicht auf eine anti-TNF-Therapie an (primäres Therapieversagen) oder entwickeln nach initialem Ansprechen ein sekundäres Therapieversagen. Da bei einem Teil dieser Patienten ein guter therapeutischer Effekt nach einem Wechsel auf einen anderen TNF-Inhibitor beobachtet wird, wird das Vorhandensein von Anti-Drug-Antikörpern (ADAb) mit einem Wirkverlust in Zusammenhang gebracht. ADAb gegen Biologika stellen die Antwort des Immunsystems auf die Applikation körperfremder Proteine dar und richten sich gegen Strukturen des entsprechenden Biologikums. Nach einer Therapie mit Adalimumab über den Zeitraum von drei Jahren waren bei 28% der RA-Patienten ADAb zu beobachten [21]. Die biologische Bedeutung von ADAb konnte inzwischen in zahlreichen Studien hinsichtlich der Korrelation von ADAb-Konzentrationen, erniedrigten Substanzspiegeln und einem Wirkverlust herausgearbeitet werden [22]. Insbesondere konnte eine Neutralisierung des funktionellen Teils des TNF-Inhibitors Adalimumab durch ADAb formal demonstriert werden, was zur Inhibition der biologischen Wirksamkeit des anti-TNF-Antikörpers führt [23]. Da inzwischen verschiedene Testsysteme zum Nachweis von ADAb sowie der TNF-Inhibitorkonzentrationen im Serum zur Verfügung stehen und unter Berücksichtigung dieser Befunde wird deshalb vorgeschlagen, bei den Patienten eine Überwachung hinsichtlich der Substanzkonzentration und ADAb durchzuführen (siehe Abbildung 3) [22].

Abbildung 3:

Vorschlag für einen Entscheidungsalgorithmus unter Berücksichtigung der TNF-Inhibitorkonzentration und des ADAb-Nachweis.

Modifiziert nach [22].

HLA-B27

Bisher ist lediglich der HLA-B27-Nachweis als Biomarker für die Spondyloarthritiden etabliert und wird in den aktuellen Klassifikationskriterien berücksichtigt. Allerdings kann HLA-B27 auch bei ca. 10% der Gesunden detektiert werden, was die Spezifität und damit auch die klinische Relevanz einschränkt. Mit der Durchflusszytometrie unter Verwendung monoklonaler Antikörper, mit den PCR-Methoden unter Verwendung von sequenz-spezifischen Primer (SSP) und mit der Sequenzierung des HLA-B27-Gens als Gold-Standard haben sich mehrere Methoden zum Nachweis von HLA-B27 etabliert. Die Durchflusszytometrie stellt ein schnelles und kostengünstiges Verfahren dar, bei dem allerdings die Kreuzreaktivität der verwendeten Antikörper mit anderen Oberflächenantigenen wie HLA-B7 und HLA-B37 die Spezifität des Verfahrens limitiert [24]. Bei Verwendung des FD705-Antikörper-Assays konnte gezeigt werden, dass durch Optimierung des Cut-Offs der mean fluorescence intensity (MFI) eine für die klinische Routine ausreichend hohe Sensitiviät von 98,2% und eine Spezifität von 97,6% erreicht werden kann. Ein weiterer häufig eingesetzter Antikörper ist der GS145.2 Antikörper-Assay, welcher bei Verwendung des Hersteller-Cut-offs zwar eine Sensitivität von 100% bei einer allerdings geringen Spezifität von 71,4% erreicht. Durch Verwendung eines in einer Studie vorgeschlagenen modifizierten Cut-Offs kann aber eine deutlich verbesserte Spezifität von 88,6% bei nur gering verschlechterter Sensitivität von 95,2% erreicht werden. Dennoch empfiehlt sich bei Verwendung des GS145.2 Antikörper-Assay eine Nachtestung mittels FD705-Antikörper-Assays in einem bestimmten kritischen Bereich der MFI. Damit kann eine Sensitivität von 98,8% und eine Spezifität von 97,6% erreicht werden [25].

Die Standard-PCR mit sequenz-spezifischen Primer (SSP) und die praktikableren darauf basierenden Real-Time-PCR-Verfahren stellen eine weitere hochspezifische und hochsensitive Alternative dar. Im Vergleich zum Goldstandard der DNA-Sequenzierung wird dabei je nach verwendetem Primermix eine Sensitivität von 99,6% und eine Spezifität von 100% erreicht [25]. Je nach verwendetem Primer ergeben sich aber auch Einschränkungen, da teilweise nicht alle Subtypen erfasst werden: Bei Verwendung des Protokolls der PCR nach Olerup werden die Subtypen B*27:12, B*27:16, B*27:18 und B*27:23 nicht amplifiziert und bei der PCR nach Dominguez die Subtypen B*27:07, B*27:14, B*27:19 und B*27:21 [26]. Da in unterschiedlichen ethnischen Gruppen die Häufigkeiten der auftretenden Allele variieren, kann die Sensitivität des gleichen Testverfahrens bei Patienten verschiedener ethnischer Herkunft ebenfalls variieren und zu vermehrt falsch-negativen Resultaten führen [26]. Eine weitere mögliche Verbesserung stellt der EUROArray HLA-B27-Direct von der Firma Euroimmun dar, der laut Hersteller alle bekannten HLA-B27-Allele erfasst. Darüber hinaus werden die nicht krankheitsassoziierten Subtypen HLA*B27:06 und HLA*B27:09 angezeigt [27].

Anti-CD74-Antikörper

Vor dem Hintergrund der Prävalenz von HLA-B27 in 10% der gesunden Bevölkerung wurde von einer Arbeitsgruppe durch den Einsatz von Protein-Arrays nach neuen Autoantikörpern bzw. Autoantigenen bei Patienten mit ankylosierender Spondylitis (SpA) gesucht [28]. Durch diese Methodik konnten erstmals Autoantikörper gegen das CD74 Protein (anti-CLIP-AK) bei diesen Patienten nachgewiesen werden. Nach Etablierung eines spezifischen ELISA wurde in unterschiedlichen Patientenkohorten die Häufigkeit von anti-CD74-Antikörpern analysiert. Hierbei zeigten sich anti-CD74 IgG-Autoantikörper bei SpA-Patienten in einer Häufigkeit von 69%, während diese Autoantikörper bei 45% der untersuchten Patienten mit Psoriasisarthritis ohne axiale Krankheitsmanifestation, 11% der RA-Patienten, 15% der SLE-Patienten, 2,5% der HIV-Patienten und 0,8% der gesunden Blutspender detektiert werden konnten. Diese vielversprechenden Ergebnisse wurden auch von einer weiteren Arbeitsgruppe bestätigt, die in anderen Patienten-Kohorten einen positiven Nachweis von anti-CLIP-AK bei 85,1% der Patienten mit axialer Spondyloarthritis führen konnte, während diese Autoantikörper nur bei 7,8% der Kontrollpatienten festzustellen waren. Bei 23,6% der Patienten mit axialer Spondyloarthritis war kein HLA-B27 detektierbar, während lediglich bei 14,9% dieser Patienten keine anti-CLIP-AK nachgewiesen werden konnten. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für den positiven anti-CLIP-AK-Nachweis hinsichtlich der Diagnose einer axialen Spondyloarthritis eine Sensitivität von 85,1% und eine Spezifität von 92,2% (LR+: 10,8; LR–: 0,08) kalkuliert [29]. Autoantikörper gegen CD74 (anti-CLIP-AK) sind also ein vielversprechender neuer Biomarker für die Spondyloarthritiden mit axialer Manifestation. Der Stellenwert muss allerdings noch in weiteren Studien evaluiert werden.

Anti-MCV-Antikörper

Autoantikörpern gegen mutiertes citrulliniertes Vimentin (anti-MCV-AK) gehören zur Gruppe der anti-citrullinierten Protein/Peptid-Antikörper (ACPA) und stellen mit einer Spezifität von 94% einen wichtigen Marker zur Diagnosesicherung einer rheumatoiden Arthritis dar [30]. Doch auch bei SpA-Patienten konnte das Auftreten von anti-MCV-AK beobachtet werden. In einer Studie von 2012 waren bei den insgesamt 43 eingeschlossenen SpA-Patienten signifikant höhere Serumspiegel von anti-MCV-AK gegenüber der gesunden Kontrollgruppe nachzuweisen (17,3 U/mL vs. 8,9 U/mL (p<0,01)). Wurde der empfohlene Cut-Off des Herstellers (>20 U/mL) angewendet, ergab sich bei 37% der SpA-Patienten eine Erhöhung der anti-MCV-AK, während bei keinem gesunden Probanden der Kontrollgruppe der Cut-Off überschritten wurde [31]. Diese Daten verleiten zur Annahme, dass bei positivem anti-MCV-AK-Nachweis und typischen klinischen Symptomen ohne Hinweis auf eine RA, der Nachweis von anti-MCV-AK eine hohe Spezifität bezüglich der Diagnose einer SpA erreichen könnte. Die geringe Studiengröße ist allerdings ein deutlich limitierender Faktor, sodass die Relevanz dieser Beobachtung inklusive genauer Erhebungen bezüglich Sensitivität und Spezifität in weitere Studien evaluiert werden muss.

Anti-β2-Glykoprotein-I-Antikörper

Die aktuell gültigen überarbeiteten Klassifikationskriterien für das Antiphospholipid-Syndrom (APS) von 2006 enthalten hinsichtlich der autoimmunologischen Diagnostik den Nachweis von anti-Cardiolipin-AK (aCL) oder anti-β2-Glykoprotein-I-Antikörpern (anti-β2GPI) sowie des Lupus-Antikoagulans, wobei ein positives Testergebnis frühestens nach 12 Wochen zu bestätigen ist [32]. Bisher werden bei den aCL- und anti-β2GPI-AK nur die Isotypen IgG und IgM berücksichtigt, obwohl auch für den IgA-Isotyp dieser Antikörper eine Assoziation mit klinischen Manifestationen des APS sowie eine besondere pathophysiologische Relevanz in Tiermodellen bekannt ist. Es wurde deshalb von einer Arbeitsgruppe in 3 großen Patientenkohorten (insgesamt 5871 Patienten) die Häufigkeit von isolierten anti-β2GPI-IgA-Antikörpern untersucht [33]. Insgesamt konnte ein positiver anti-β2GPI-IgA-Titer bei 198 Patienten bestimmt werden, von denen 57 Patienten nur für die anti-β2GPI-IgA-Antikörper positiv getestet wurden. Von diesen Patienten war bei 70,1% mindestens eine klinische APS-Manifestation nachweisbar. Zudem zeigte sich eine positive Korrelation mit dem Auftreten venöser und arterieller Thrombosen. In vivo Experimente im Mausmodell zeigten außerdem eine größere Thrombusformation nach Transfer von anti-β2GPI-IgA-Antikörpern.

Es bleibt deshalb festzuhalten, dass bei klinischem Verdacht und fehlendem Nachweis des Lupusantikoagulans und aCL- bzw. anti-β2GPI-Antikörpern der Isotypen IgG und IgM eine Bestimmung der anti-β2GPI-IgA-Antikörper zu empfehlen ist.

Diagnostischer Algorithmus

In den letzten 10 Jahren wurde das neue Konzept der IgG4-assoziierten Erkrankungen (IgG4-RD) entwickelt, die inzwischen als eigenständige Krankheitsentität zusammengefasst werden [34]. Die IgG4-RD zeichnen sich durch ein besonderes pathohistologisches Muster (Gewebeinfiltration mit IgG4 exprimierenden Plasmazellen, storiforme Fibrosierung, obliterierende Phlebitis sowie geringgradige bis moderate Eosinophilie) aus [35]. Als fibroinflammatorische Multisystemerkrankung sind bei den betroffenen Patienten häufig (zeitgleich oder nacheinander) multiple Organsysteme und Körperregionen betroffen.

Die Ätiologie und genaue Pathogenese dieser Erkrankungen sind bisher unbekannt. Neben einer autoimmunen Genese wird auch eine allergische Ursache diskutiert, die zu einer Dysregulation der T-Zellen mit Ausbildung einer TH2-Antwort und konsekutiver Gewebeinfiltration mit IgG4 exprimierenden Plasmazellen führt. Die Diagnosestellung erfolgt in der Gesamtschau der Klinik, Bildgebung, Histologie und Laborbefunde. Hinweisend auf eine IgG4-RD können erhöhte IgG4-Serumkonzentrationen sein (>135 mg/dL). Allerdings finden sich nur bei etwa 80% der Patienten erhöhte IgG4-Spiegel im Serum, während auch bei ca. 5% der Normalbevölkerung erhöhte IgG4-Konzentrationen bestimmt werden können.

Als wichtigster Befund gilt deshalb der histologische Nachweis eines erhöhten Anteils von IgG4 exprimierenden Plasmazellen im Gewebe, wofür Spezialfärbungen erforderlich sind [34, 35]. Im Jahr 2012 wurden internationale Konsensusempfehlungen für die histologische Diagnostik publiziert, die zusammen mit den 2011 in Japan veröffentlichten diagnostischen Kriterien gegenwärtig die Grundlage für die Diagnosestellung bilden. Unter Berücksichtigung der wichtigsten Aspekte dieser beiden Publikationen wurde ein diagnostischer Algorithmus vorgeschlagen, der in Abbildung 4 dargestellt ist [36].

Abbildung 4:

Diagnostische Kriterien der IgG4-RD.

Modifiziert nach [36].

Bestimmung der IgG4-Serumkonzentration

Als wichtiges Kriterium für die Diagnosestellung einer IgG4-RD gilt eine erhöhte IgG4-Serumkonzentration >135mg/dL, was allerdings nur bei ca. 80% der Patienten mit histologisch gesicherter IgG4-RD zu beobachten ist [34–36]. Zudem wurden bei konsekutiven IgG4-Bestimmungen beim gleichen Patienten stark abweichende Befunde beobachtet, die nicht mit den klinischen Befunden übereinstimmten, was einem „high dose hook effect“ („prozone effect“) zugeordnet wurde. Vor diesem Hintergrund wurden von einer Arbeitsgruppe die Serumproben einer IgG4-RD-Patientenkohorte systematisch hinsichtlich eines „prozone effects“ bei der IgG4-Bestimmung untersucht [37]. Hierbei zeigte sich, dass bei 10 der 38 untersuchten Serumproben initial zu niedrige IgG4-Konzentrationen bestimmt worden waren. Durch die wiederholte Analyse von Serumverdünnungen konnte zudem nachgewiesen werden, dass alle falsch niedrigen IgG4-Serumkonzentrationen auf einen „prozone effect“ zurückzuführen waren, der durch entsprechende Verdünnungsstufen vermieden werden konnte.

Schub der Autoimmunerkrankung versus Infektion

Im klinischen Alltag ist die Unterscheidung zwischen einem Schub der Autoimmunerkrankung und einer Infektion häufig zu treffen, aufgrund der ähnlichen klinischen Symptomatik jedoch oft schwierig. Hilfreich sind deshalb Marker, die eine Abgrenzung dieser Situationen erlauben, um eine fundierte Therapieentscheidung zu ermöglichen (Intensivierung der Immunsuppression versus antiinfektiöse Therapie). In der Routinediagnostik hat sich diesbezüglich die Bestimmung des Procalcitoninwertes (PCT) etabliert, der bei positivem Ergebnis auf eine zugrunde liegende systemische bakterielle Infektion hinweist. Inzwischen wurde der Stellenwert des PCT-Wertes in dieser Situation in zwei Meta-Analysen untersucht [38, 39]. In der einen Metaanalyse wurde unter Berücksichtigung von neun Studien hinsichtlich des Vorliegens einer bakteriellen Infektion eine Sensitivität von 0,75 (95% CI 0,63–0,84) und eine Spezifität von 0,90 (95% CI 0,85–0,93) für den PCT-Test kalkuliert, gegenüber einer Sensitivität von 0,77 (95% CI 0,67-0,85) und einer Spezifität 0,56 (95% CI 0,25-0,83) für den CRP-Test. Für den PCT-Wert wurde in dieser Studie eine positive likelihood ratio von 7,28 (95% CI 5,10-10,38) und negative likelihood ratio von 0,28 (95% CI 0,18-0,40) berechnet [38]. Ähnliche Ergebnisse zeigte auch die zweite Metaanalyse hinsichtlich der diagnostischen Wertigkeit des PCT-Wertes bei Osteomyelitis und septischer Arthritis [39]. Zusammenfassend kann also im klinischen Alltag der Befund eines deutlich erhöhten PCT-Wertes einen wertvollen Beitrag hinsichtlich der Abgrenzung eines Schubes der Autoimmunerkrankung von einer bakteriellen Infektion leisten, wobei allerdings immer auch die anderen Befunde des Patienten bei der differentialdiagnostischen Einordnung berücksichtigt werden müssen. Keinesfalls lässt sich durch einen normwertigen PCT-Befund eine bakterielle Infektion sicher ausschließen.

Maskierung der Akut-Phase-Marker durch Immunsuppression

Durch eine immunsuppressive Therapie kann die Immunreaktion auf Krankheitserreger erheblich beeinträchtigt werden, was sich sowohl in einer Suppression der Akut-Phase Marker als auch in einer verminderten serologischen Antwort auf Impfungen widerspiegeln kann. In einer Metaanalyse konnte beispielsweise gezeigt werden, dass bei mit Rituximab behandelten RA-Patienten die Ansprechrate nach einer Pneumokokkenimpfung (gemessen am Anstieg des Antikörpertiters) für den Serotyp 6B [OR 0,25 (95% CI 0,11–0,58)] als auch für den Serotyp 23F [OR 0,21 (95% CI 0,04–1,05)] vermindert wird [40]. Eine genaue Medikamentenanamnese ist deshalb bei V.a. auf eine Infektion bei immunsupprimierten Patienten unerlässlich. Im klinischen Alltag werden insbesondere der CRP-Wert und die BSG verwendet, um das Ausmaß einer Entzündungsreaktion abzuschätzen. Allerdings können diese Parameter erheblich durch konventionelle sowie biologische Immunsuppressiva und auch Steroide beeinflusst werden, weshalb ein eigentlich infektionsbedingter adäquater Anstieg unterbleiben kann oder deutlich geringer ausfällt. Da die Freisetzung des CRP in den Hepatozyten durch IL-6 reguliert wird, ist es nicht verwunderlich, dass eine Suppression bzw. Maskierung der Akut-Phase-Marker auch unter einer IL-6 inhibierenden Therapie beobachtet wird. So wurden in verschiedenen Fallberichten ein fehlender Anstieg bzw. Suppression des CRP-Wertes trotz systemischer bakterieller Infektion unter einer Therapie mit dem anti-IL6-Rezeptor-Antikörper Tocilizumab beschrieben [41, 42]. Ob in dieser Situation der PCT-Wert zuverlässig als diagnostischer Marker eingesetzt werden kann, ist Gegenstand aktueller Untersuchungen.

Immunmonitoring mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie

Opportunistische Infektionen können sich bei immunsuppressiv behandelten Patienten aufgrund einer zu starken Immunsuppression manifestieren. Bisher ist kein umfassendes Immunmonitoring bei diesen Patienten etabliert, das eine Therapiesteuerung ermöglicht und eine überschießende Immunsuppression verhindert. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie erlaubt die simultane phänotypische Charakterisierung zahlreicher verschiedener Zellpopulationen im peripheren Blut, was bei longitudinaler Analyse möglicherweise ein genaueres und individuelles Immunmonitoring ermöglicht. Hierfür ist allerdings eine Standardisierung und Validierung der Methode an größeren Patientenkollektiven erforderlich. Aufgrund der besonderen pathophysiologischen Relevanz und der Effekte zahlreicher Immunsuppressiva wurden typische Oberflächenmarker für die Analyse von T- und B-Zell-Subpopulationen mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie vorgeschlagen, die in zukünftigen Studien evaluiert werden sollen (siehe auch Tabelle 3) [43]. In einer prospektiven monozentrischen Studie wurden 39 RA-Patienten, welche 1 g Rituximab im Abstand von 15 Tagen erhielten, alle 2 Monate bis zur Reinduktion nachverfolgt und die B-Zell-Subpopulationen bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Anstieg der CD19+/CD38++/CD24++ Transitionalen B-Zellen (p=0,007) und der CD19+/CD27+ B-Gedächtniszellen (p=0,01) einen erneuten Krankheitsschub innerhalb von 4 Monaten vorhersagen konnte. Die Überwachung einzelner Subpopulationen von Immunzellen könnte zukünftig also ein effektives Werkzeug zur Therapiesteuerung darstellen [44].