NMR-Spektroskopie – ein modernes Werkzeug zur Serum-Analytik von Lipoproteinen und Metaboliten

NMR-Spektroskopie

Die NMR (Nuclear Magnetic Resonance) Spektroskopie ist eine analytische Messmethode, die es ermöglicht, auf molekularer Ebene Aussagen über die Konzentration, die Zusammensetzung und die Struktur von einfachen oder komplexen Molekülen und Mischungen zu treffen, ohne dabei die Probe selbst zu verändern. Dies kann in Flüssigkeiten, aber auch in Festkörpern geschehen. Das Prinzip beruht auf der Wechselwirkung einzelner Kernspins – im einfachsten Fall Protonen bzw. Wasserstoff (¹H) – mit einem starken, von außen angelegten statischen Magnetfeld, in dem sich die Spins entlang des Magnetfelds (in z-Richtung) ausrichten (Abbildung 1).

Abbildung 1

Vereinfachte Darstellung der NMR-Methodik.

Die in organischen Molekülen vorkommenden Kernspins verhalten sich ähnlich wie kleine Magnete. Während sie in Lösung statistisch orientiert sind, richten sie sich im äußeren Magnetfeld vorzugsweise parallel aus. In ihrer Summe ergeben sie eine makroskopische Magnetisierung der Spins in z-Richtung. Durch gezielte Anregung der Spins mittels Radiofrequenz rotieren die Spins. Die makroskopische Magnetisierung wird in die Waagerechte gebracht und rotiert ihrerseits nach Abschalten des Pulses im statischen Feld. Dabei bestimmt die unmittelbare Umgebung des Kernspins (z.B. chemische Bindungen, elektrostatische Wechselwirkungen, Lösungsmittelmatrix, etc.) dessen Resonanzfrequenz, welche schließlich im NMR-Spektrum als Signal wiedergegeben wird. Spezifische Moleküle sind daher an ihren charakteristischen Signalmustern eindeutig zu erkennen.

Mittels geeigneter Radiofrequenzimpulse senkrecht zum statischen Magnetfeld können die Spins, die sich in Resonanz mit dem eingestrahlten Impuls befinden, gezielt angeregt und somit ausgelenkt werden. Das führt zu einer Präzession der Spins, die mit der eines Kreisels vergleichbar ist, der durch kurzes Anstoßen in seiner Bewegung gestört wurde. Die Frequenz dieser Präzession in der x-y-Ebene ist die eigentliche Messgröße und hängt von der Stärke des von außen angelegten Magnetfelds ab. Sie wird als Larmor-Frequenz bezeichnet.

Die angeregten Kernspins können solange detektiert werden, bis sie wieder in ihren Gleichgewichts-Zustand – parallel zum äußeren Magnetfeld – zurück relaxieren (Longitudinale oder T₁-Relaxation). Tatsächlich fällt das detektierte Signal jedoch noch schneller ab, da verschiedene Kernspins mit unterschiedlichen Resonanzfrequenzen präzedieren. Mit der Zeit verlieren sie somit an Kohärenz, so dass die Spins in unterschiedliche Richtungen zeigen und sich ihr Signal in der Summe gegenseitig aufhebt (Transversale oder T₂-Relaxation).

Die Resonanzfrequenz eines spezifischen Kernspins wird durch die chemische Umgebung des Kerns beeinflusst: Befindet sich ein Proton beispielsweise in direkter Nachbarschaft zu einem aromatischen Ring oder einer Carbonsäuregruppe, wird es weniger stark vom Magnetfeld abgeschirmt als ein anderes Proton, das lediglich an einen aliphatischen Rest gebunden ist. Das führt zu sogenannten chemischen Verschiebungen, die die Frequenz des Signals relativ zu einem festen Standard beschreibt [1, 2].

NMR-Methoden

Neben Wasserstoff, der ubiquitär in allen organischen Molekülen vorkommt, kann man unter anderem auch ¹³C, ¹⁵N oder ³¹P messen und somit zusätzliche wichtige Informationen über andere Kerne erhalten. Außerdem ist es möglich, mehrdimensionale NMR-Spektren aufzunehmen, die entweder homonuklear die Kopplung zwischen zwei identischen Kernarten (meist nur ¹H) oder heteronuklear die Kopplung zwischen verschiedenen Kernarten (z.B. ¹H und ¹³C oder ¹H und ¹⁵N) messen. So kann man zum einen Aussagen über Bindungsmuster und Spinsysteme treffen, zum anderen ist es auch möglich, Abstände zwischen je zwei Kernen über den NOE (Nuclear Overhauser Effect) zu bestimmen und so komplette Strukturen von Proteinen oder anderen Makromolekülen zu entschlüsseln [1–3].

Die Feinstruktur einzelner Signale im Spektrum gibt Auskunft über die direkten Nachbarkerne, mit denen der beobachtete Kern ‚koppelt‘. Diese sogenannten J-Kopplungen führen dazu, dass Signale nicht nur als einfache Lorentz-Linien erscheinen (Singuletts), sondern als Dubletts, Tripletts, Quartetts oder auch Multipletts. Diese Aufspaltungsmuster führen zu komplexeren Spektren mit zusätzlicher Information, erschweren allerdings auch deren Interpretation. Mit Hilfe eines geeigneten 2D Jres (J-resolved) Pulsprogrammes können diese Kopplungen in eine zweite Dimension überführt werden, so dass man in der ersten Dimension ein stark vereinfachtes Spektrum erhält und in der zweiten Dimension eine genaue Beschreibung der Kopplungsmuster [3, 4].

Relaxationsmessungen werden dazu verwendet, die Zeit zu bestimmen, die ein Kern braucht, um nach dessen Anregung wieder in den Gleichgewichts-Zustand zurückzukehren. Dabei können sowohl die T₁- als auch die T₂-Relaxationszeiten nicht nur für gesamte Moleküle, sondern auch für jeden einzelnen Kern, der an ein Molekül gebunden ist, variieren. Hier spielen äußere Effekte wie Viskosität oder Temperatur eine entscheidende Rolle. Relaxationszeiten sind allerdings tendenziell länger für kleinere Moleküle, was auf deren höhere Beweglichkeit und den geringeren Energieaustausch mit ihrer Umgebung zurückzuführen ist. Diesen Umstand kann man sich zunutze machen und über sogenannte relaxationseditierte Pulsprogramme gezielt schon bei der Messung über spezifische Relaxationszeiten filtern [3, 5].

Ein ähnliches Verfahren ist auch mit diffusionseditierten Pulsprogrammen möglich. Diffusionsmessungen zielen darauf ab, unterschiedliche Substanzen nicht – wie vorhin beschrieben – nach ihren Relaxationszeiten zu filtern, sondern nach ihrem Diffusionsverhalten. Die Diffusion hängt stark mit der Beweglichkeit und der Größe des entsprechenden Moleküls oder Makromoleküls zusammen. Je schneller sich ein Molekül bewegt, desto mehr Signalverlust erhält man in diffusionsgewichteten Spektren. Misst man mehrere unterschiedlich gewichtete Diffusionsspektren hintereinander, ist es sogar möglich den absoluten Diffusionskoeffizienten eines Moleküls in der Lösung zu bestimmen und somit Rückschlüsse auf dessen Größe bzw. Radius zu ziehen. Auch hier kann man speziell editierte Pulsprogramme verwenden, die nur die langsam diffundierenden Partikel heraus filtern, oder über die Differenz zum ursprünglichen Spektrum entsprechend die hoch beweglichen Moleküle abbilden [6–8].

Bislang war die NMR-Spektroskopie Experten vorbehalten, die die komplexen Geräte beherrschen, was einen Routineeinsatz in der Diagnostik weitgehend unmöglich machte. Aktuelle Angebote kommerzieller Anbieter haben diese Hürde durch umfassende Automatisierung und Standardisierung jedoch inzwischen weitestgehend beseitigt, sowohl auf der Seite der Probenvorbereitung als auch bei der eigentlichen Messung. Geräte, wie sie üblicherweise in der Forschung zum Einsatz kommen, können zwar auch die technischen Anforderungen erfüllen, stoßen jedoch hinsichtlich der Prozesskontrolle und Softwarestandardisierung häufig an ihre Grenzen. Der Vorteil kommerzieller Systeme zeigt sich auch in punkto Probendurchsatz, so ist es mittlerweile möglich mehrere hundert Proben pro Gerät und Tag zu messen. Als aufstrebende Technologie bietet die NMR-Spektroskopie somit flexible und anspruchsvolle Analysemöglichkeiten, die schon bald Eingang in die klinischen Labore finden könnten.

Analyse von Metaboliten

Neben Proteinen und Lipoproteinen, die als globuläre Aggregate vorliegen, befinden sich in Serum hauptsächlich kleine Moleküle, die sich mehr oder weniger uneingeschränkt bewegen können. Während Salze der ¹H-NMR-Spektroskopie aufgrund mangelnden Wasserstoffs nicht zugänglich sind, kann man monomere Bausteine wie Zucker oder Aminosäuren eindeutig zuordnen. Sie liefern sehr schmale Signale und können daher leicht quantifiziert werden.

Mittlerweile lassen sich beinahe alle Signale im Serum-Spektrum eines Spenders identifizieren. Über verschiedene ein- und zwei-dimensionale, sowie relaxations- oder diffusionseditierte Pulsprogramme wurden sowohl kleine Metabolite als auch Lipoprotein- und Proteinsignale zugeordnet [5, 9]. Es konnten auch über die Unterdrückung kleiner Metabolite während der Messung erstmalig Spektren von Lipoproteinen generiert werden, die nicht vorher erst aus Serum isoliert werden mussten. Vielmehr konnten sogar beliebige Spektren basierend auf der unterschiedlichen Beweglichkeit der Moleküle über geeignete Kombination aus relaxations- und diffusionseditierter NMR-Spektroskopie erstellt werden [7]. Die Diffusionskoeffizienten einiger Metabolite wurden außerdem mit Hilfe von zweidimensionaler homonuklearer TOCSY (Total Correlated Spectroscopy) gleichzeitig in einer einzigen Serumprobe bestimmt [10].

Die NMR-Spektroskopie liefert zahlreiche Mittel zur gezielten Selektion der gewünschten Information und auch zur Strukturaufklärung, doch will man die tatsächliche Konzentration einer Substanz absolut bestimmen, greift man im besten Fall auf die ¹H-NMR-Spektroskopie zurück, die nicht nur im Vergleich zu anderen Methoden deutlich schneller ist, sondern auch ohne weiteres Zutun oder mit Hilfe von einfachen Korrekturberechnungen quantitative Ergebnisse liefert [11].

Zur quantitativen Analyse von kleinen Metaboliten ist es von Vorteil, den Untergrund zu beseitigen, der durch die Makromoleküle hervorgerufen wird. Es konnte gezeigt werden, dass diffusionseditierte Pulsprogramme nahezu identische NMR-Spektren der hochmolekularen Bestandteile lieferten wie normale ¹H-Spektren von ultrafiltrierten Serumproben aus dem Labor [8]. Über Differenzbildung zum NMR-Spektrum von gesamtem Serum konnten somit einzig die kleinen Moleküle dargestellt und effizient quantifiziert werden.

Differenzierte Analyse von Lipoproteinen

Die Analyse von Lipoproteinen (LP) ist alles andere als trivial, da sich ein einziges Partikel aus Hunderten von Lipiden und einigen wenigen Proteinen, den Apolipoproteinen, zusammensetzt. Diese Partikel weisen eine zusätzliche Diversität auf, da die einzelnen LP-Klassen (CM, VLDL, LDL und HDL) nicht homogen sind, sondern auch Unterschiede in Zusammensetzung und Größe zeigen [12]. Im Serum befindet sich somit eine komplexe Verteilung von heterogenen LP-Klassen, die außerdem durch diverse Serumproteine und Metabolite überlagert werden. Die Zusammensetzung der LP und Lipide in Serum spiegelt sich schließlich in der Kurvenform der NMR-Spektren wieder.

Aufgrund der chemischen Verschiebung von unterschiedlich großen Partikeln ist eine differenzierte Quantifizierung zahlreicher LP-Subklassen möglich. Es wurde gezeigt, dass sich das Verhältnis von Partikelinnerem (in dem die Lipide unstrukturiert verteilt sind) zur Partikelmembran (in dem die Lipide radial geordnet vorliegen) in einer allgemeinen Richtungsabhängigkeit der Magnetisierbarkeit äußert, also parallel zum Magnetfeld oder senkrecht zum Magnetfeld. Für größere Partikel ergibt sich daraus eine geringere Abschirmung und folglich eine höhere chemische Verschiebungen als für kleinere Partikel [13].

Dieser Größenshift ist ausreichend groß, um eine Differenzierung zu erhalten und wurde erstmals Anfang der 1990er Jahre zur Quantifizierung von LP in Serum genutzt [14–17]. Dazu wurden NMR-Spektren von isolierten LP (VLDL, LDL und HDL) aufgenommen und als Basis für einen Fit-Algorithmus verwendet, mit dem die Methylregion von Serumspektren durch Linearkombination der Basisspektren rekonstruiert wurde. Anhand der Intensität der gefitteten Basisspektren konnte auf die LP-Verteilung rückgeschlossen und zudem eine hohe Korrelation (r>0,8) zu den klassisch bestimmten Lipidkonzentrationen gefunden werden, die in den jeweiligen LP in besonders hohem Maße vorkamen. Somit war es nicht nur möglich die LP selbst zu quantifizieren, sondern auch die darin befindlichen Lipide.

Dieser Ansatz wurde mit Hilfe neuronaler Netze noch weiter vorangetrieben. Im Gegensatz zu Fitmethoden liefert diese Variante ein mathematisch unabhängiges Modell, das nicht auf Spektren isolierter LP beruht [18, 19]. Dazu wurden Serumspektren aufgenommen und über enzymatische Methoden die dazugehörigen Lipidkonzentrationen der einzelnen isolierten LP bestimmt. In einem Trainingsset wurde der Methyl- und Methylenbereich der NMR-Spektren mit den entsprechenden Lipidkonzentrationen in Relation gesetzt und die erlernte Vernetzung anschließend an einem unbekannten Testset überprüft. Die Korrelation zu den biochemischen Daten war sehr gut (r=0,70–0,99), so dass alle LP-Hauptkomponenten mit hoher Genauigkeit und in sehr kurzer Zeit bestimmt werden konnten.

Ein Vergleich dieser neuronalen Netze mit multivariaten Analysemethoden, insbesondere PLS-Modellen (Partial Least Squares), bestätigten die guten Korrelationen nicht nur für verschiedene Lipidkonzentrationen (r=0,73–0,99), sondern auch erstmalig für die Proteinkomponenten ApoAI (r=0,92) und ApoB (r=0,97) [20]. Ähnlich gute Werte lieferten statistische Algorithmen wie MCMC-Verfahren (Markov Chain Monte Carlo) [21].

Weiterhin ist es möglich, die Partikelgröße anhand der Diffusion im NMR zu erfassen. Dies geschieht in sogenannten diffusionsgewichteten Spektren (Diffusion Ordered Spectroscopy, DOSY), in denen sich letztlich die Diffusionskoeffizienten von LP bestimmen lassen. Auch direkte Rückschlüsse auf die Partikel-Radien sind hierbei möglich und wurden 2012 in einer Studie an isolierten LP bestimmt [22]. Die Korrelation zu Partikelgrößen, die mittels Elektronenmikroskopie bestimmt wurden, war sehr gut (r=0,9).

Eine quantitative Bestimmung der LP-Klassen durch deren nur leicht unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten ist schwierig und kann über ein einfaches DOSY-Spektrum von Serum aufgrund der komplexen Überlagerung der LP nicht bewerkstelligt werden [23]. Über die Kombination mit mehrdimensionalen chemometrischen Zerlegungsmethoden lässt sich jedoch auch diese Methode zur Quantifizierung von LP und diversen LP-Subklassen verwenden [24].

Die verschiedenen Analysemöglichkeiten sind mit mehr oder weniger Arbeits- und Zeitaufwand verknüpft. Letztendlich kann man aber schon anhand einfacher ¹H-Spektroskopie in wenigen Minuten eine ansehnliche Fülle an Informationen über die Zusammensetzung und die Konzentration unterschiedlichster Metabolite erhalten, besonders in Kombination mit mathematischen Auswerteverfahren. Die Ergebnisse korrelieren meist sehr gut mit herkömmlichen Methoden, sind aber weniger zeitaufwändig, können automatisiert werden und bergen daher auch weniger Fehlerquellen.

Lipoproteine

Die Verteilung der LP-Klassen und Subklassen im Blut steht seit langem im Fokus der Forschung und wird mit vielen Krankheitsbildern in Verbindung gebracht. Da sich mit unterschiedlicher Zusammensetzung die Kurvenformen in NMR-Spektren signifikant ändern, ist eine akkurate Analyse vielversprechend.

Bereits Ende der 80er Jahre wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen bösartigen Tumorerkrankungen und der Linienbreite von Methyl- und Methylensignalen in ¹H-NMR-Spektren von Serum kontrovers diskutiert [36, 37]. Wie sich zeigte, war tatsächlich ein erhöhter TG- und damit auch VLDL-Spiegel und eine entsprechend geringere HDL-Konzentration – wie sie in gesunden Patienten zu finden ist – der Grund für die schmäleren Linien [38–40]. Der Einsatz multivariater Fitmethoden an NMR-Spektren ermöglichte hier eine detaillierte Aussage über die relativen Konzentrationen der Lipoproteine (VLDL, LDL und HDL) zueinander [41].

Die Verwendung ebensolcher Fitmethoden zeigt den immensen Vorteil der NMR gegenüber alternativen Analysemethoden. Während standardmäßig die Konzentration der Lipide (Cholesterin oder TG) in Serum oder vorab isolierten LP gemessen wird, liefert die NMR Informationen über Anzahl und Größe der jeweiligen Partikel ohne einen vorherigen Separationsschritt. 2002 wurde diese Eigenschaft im Rahmen der Framingham Offspring Study an 3437 Probanden herausgestellt [42]. An einem Subset der Teilnehmer wurde gezeigt, dass kein direkter Zusammenhang zwischen der Konzentration der LDL-Partikel und des darin enthaltenen Cholesterins gefunden werden konnte, da die Lipidzusammensetzung in LDL extrem variiert. Mit klassischen Bestimmungsmethoden könne dieser Umstand nicht berücksichtigt werden. Eine hohe Konzentration an LDL-Cholesterin könne entweder bedeuten, dass viele Partikel mit jeweils geringem Cholesteringehalt oder wenige Partikel mit hohem Cholesteringehalt vorliegen. Erstere Gruppe würde von einer LDL-senkenden Therapie profitieren, eine Erkennung sei durch eine konventionelle Analyse jedoch nicht möglich [42].

Die unterschiedlichen Größen von VLDL und LDL wurden ebenso über NMR-Spektroskopie untersucht. In einer Studie an 918 Kindern im Alter von 10 bis 17 Jahren wurde gezeigt, dass Jungen im Vergleich zu Mädchen durchschnittlich um 0,1 nm kleinere LDL- und um 0,7 nm größere VLDL-Partikel aufwiesen. Außerdem wurde eine positive Abhängigkeit der VLDL-Größe vom Alter weißer Kinder gefunden, allerdings nicht bei anderen Ethnizitäten [43]. Schwarze Kinder hatten im Allgemeinen größere LDL und kleinere VLDL, was auf unterschiedliche Lipidverhältnisse zurückzuführen war. Die entsprechenden HDL-Subklassen wurden in einer Folgestudie untersucht [44]. Hier wurden abnehmende durchschnittliche Partikelgrößen mit steigendem Alter von Jungen gemessen und im Allgemeinen größere HDL-Partikel bei Mädchen (im Vergleich zu Jungs) und bei schwarzen Kindern (im Vergleich zu weißen). Wurden allerdings die HDL-Subklassen betrachtet und nicht Gesamt-HDL, wurden teils entgegengesetzte Beobachtungen gemacht. Die Konzentration der größeren HDL-Partikel sank mit dem Alter, während die Konzentration von kleineren HDL-Partikeln mehr oder weniger konstant blieb. Zudem konnten Korrelationen zum Gewicht der Kinder, TG-Gehalt und LDL-Cholesterin gefunden werden. Weitere Erkenntnisse wurden im Vergleich des Körpergewichts der Kinder mit deren TG-Werten und verschiedenen VLDL-Subklassen erhalten [45]. Der durchschnittliche TG-Gehalt war in weißen Kindern tendenziell höher als in schwarzen, außerdem war das Verhältnis von Taillenumfang zu TG-Konzentration bzw. großen VLDL in weißen Kindern 2–6 mal so hoch wie in schwarzen Kindern.

Änderungen in LP-Profilen erhält man insbesondere bei extremen Belastungen oder Stresssituationen. Bei Triathleten hatte z.B. ein Wettkampf bei 28 Probanden einen günstigen Einfluss auf die Verteilung der LP-Klassen in ihrem Blut [46]. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde sowohl eine sehr deutliche Senkung kleiner LDL erkannt, als auch ein leichter Anstieg der großen LDL- und eine leichte Senkung der kleinen HDL-Partikel.

Ein positiver Lebensstil hat generell einen positiven Effekt auf die LP-Verteilung im Blut. 2009 wurden in einer Studie 73 Probanden dazu aufgefordert, sich über mehrere Wochen nach einer strikten vegetarischen fettarmen Diät zu ernähren und sich regelmäßig zu bewegen, was sich günstig auf ihre LDL-Werte auswirkte, wie mittels NMR-Spektroskopie bestätigt wurde [47]. Aber schon allein die Ernährungsumstellung auf eine cholesterin- und fettarme Diät bei konstant gehaltenem Körpergewicht zeigte ein günstigeres LP-Profil – bei Männern sogar noch deutlicher als bei postmenopausalen Frauen [48]. In einer anderen Untersuchung wurde nur der Einfluss von körperlicher Betätigung ohne Ernährungsumstellung betrachtet [49]. Dazu sollten die Studienteilnehmer regelmäßig Sport treiben – in drei verschiedenen Gruppen unterschiedlich intensiv – aber dabei ihr Körpergewicht halten. Die NMR-spektroskopische LP-Bestimmung zeigte, dass nicht die Intensität ausschlaggebend für das verbesserte Blutbild war, sondern die Menge an Bewegung.

Von besonderem medizinischem Interesse ist heute eine frühzeitige Erkennung und akkurate Risikoeinschätzung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Ein Bezug zur Verteilung der LP bzw. der darin befindlichen Lipide im Blut ist mittlerweile unumstritten. Die Messung von Lipid-Konzentrationen, wie sie im klinischen Routinebetrieb durchgeführt wird, liefert jedoch keine ausreichenden Aussagen über die Anzahl und Größe der LP-Partikel. Lediglich die ApoB-Konzentration sollte mit der Partikelkonzentration von LDL korrelieren, gibt aber auch keine Auskunft über deren Größe. Zudem deuten neueste Erkenntnisse darauf hin, dass es auch Abweichungen zu der bekannten Korrelation von ApoB und der Anzahl der LDL-Partikel gibt [50]. In zahlreichen NMR-Studien wurden daher Zusammenhänge des LP-Profils in gesunden und Risiko-Patienten durchgeführt. Für den Schweregrad einer Koronaren Herzkrankheit (KHK) fand man eine positive Korrelation mit großen VLDL- und kleinen HDL-Partikeln, sowie eine negative Korrelation mit durchschnittlich großen HDL-Partikeln, unabhängig vom Alter der Probanden [51]. Für LDL ergab sich in einer späteren Studie an älteren Frauen ein Zusammenhang des Krankheitsbildes mit besonders kleinen LDL und erhöhter Partikelkonzentration [52], wobei die Konzentration eine bessere Vorhersagekraft lieferte, sowohl für KHK [53] insbesondere aber auch für das Metabolische Syndrom [54]. Auch Geschlechtsunterschiede bei KHK wurden untersucht und bestätigten bereits bekannte Erkenntnisse [55]. Wenngleich auch die NMR-Spektroskopie als Risiko-Vorhersagemodell noch nicht das Niveau etablierter klinischer Diagnostik erreicht, birgt sie dennoch erhebliches Potential und dürfte sich als gute Ergänzung des klassischen Spektrums klinischer Diagnostik etablieren [56].

Neuere Untersuchungen an Makrophagen, die nach exzessiver Aufnahme von modifiziertem LDL maßgeblich an der Bildung von Arteriosklerose beteiligt sind, lieferten interessante neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet [57]. Dazu wurden Monozyten von Patienten isoliert und zu Makrophagen differenziert. Durch die Zugabe von ApoAI und HDL2 wurde das Ausströmen von Cholesterin initiiert und quantitativ bestimmt. Parallel dazu wurde das LP-Profil der Patienten mittels NMR bestimmt. Eine hohe Konzentration kleiner HDL und LDL bzw. eine niedrige Konzentration großer LP (VLDL und CM) korrelierte mit einem erhöhten Ausströmen von Cholesterin aus den Makrophagen. Im Gegensatz dazu wurde keine Abhängigkeit zu den jeweiligen Cholesterinwerten gefunden. Probanden mit signifikanter Stenose wiesen niedrigeren Ausfluss von Cholesterin auf.

Viele weitere Einflüsse wie Type-1-Diabetes [58–60], Enzymaktivität [61] oder Hormonkonzentration [62] wirken maßgeblich auf das LP-Profil ein und wurden in zahlreichen NMR-Studien untersucht.

Die Identifizierung der Genloci, die für die Ausprägung des LP-Subklassen-Profils bei KHK-Patienten verantwortlich sind, wurde 2007 erstmals untersucht [63]. Die Erblichkeit des Subklassenspektrums wurde mittels univariaten und multivariaten Berechnungen ermittelt und reichte für HDL und LDL von ca. 20% bis 50%. Zudem wurde über Kopplungsanalysen die Ausprägung der HDL-Konzentration auf das Chromosom 18 lokalisiert (LOD 3,3) und die der HDL-Partikelgröße auf das Chromosom 12 (LOD 2,9 bzw. 3,7 nach multivariater Anpassung). Die jeweiligen Konzentrationen und Partikelzahlen wurden über NMR-Spektroskopie ermittelt. Detailliertere Phänotypisierung für HDL führte außerdem zu interessanten Zusammenhängen von HDL-Größe und Stoffwechsel-Enzymen wie LIPC (hepatic triglyceride lipase), PLTP (Phospholipid transfer protein) oder FBLN5 (Fibulin-5) [64]. Über HDL-Größen, die mittels NMR-Spektroskopie erhalten wurden, wurde eine bessere Phänotypisierung erreicht als über HDL-Cholesterin-Konzentrationen. In einer erweiterten Studie mit fast 2000 Proben, deren LP-Subklassen im Detail analysiert wurden, wurden mittels Cluster-Analysen und Assoziationen zu bekannten Subfraktionen 8 Genloci identifiziert, die mit LP-Subklassen in Zusammenhang stehen und 4 Loci, die auf Serum-Lipide zurückzuführen sind [65].

Metabolomics

Unter Metabolomics versteht man die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von Metaboliten im Sinne eines metabolischen Zustandsbildes. Der Ansatz ist die logische Fortführung der Omics-basierten Forschung, die sich ausgehend von Genomics und Transkriptomics über Proteomics zu Metabolomics immer weiter dem (patho-)physiologischen Geschehen annäherte.

Dabei geht es in der Regel nicht nur wie in klassischen Biomarker-Ansätzen darum, einzelne Moleküle zu identifizieren, die als diagnostische Parameter geeignet erscheinen. Vielmehr geht der Ansatz davon aus, dass sich unterschiedliche Funktionszustände des Organismus in unterschiedlichen metabolischen Mustern widerspiegeln. So verändern Faktoren wie Ernährung, Aktivität und nicht zuletzt Erkrankungen die Steady-States unterschiedlicher Stoffwechselwege. Diese zu messen und die relevante Information aus den Daten zu filtern ist die Herausforderung, die es in der Entwicklung der Metabolomics-Diagnostik zu meistern gilt [66].

Wie oben dargelegt, eignet sich die NMR-Spektroskopie hervorragend zur reproduzierbaren Erfassung metabolischer Parameter und stellt somit eine wichtige technologische Säule in diesem Feld dar. Entsprechend wurde die Methode bereits in zahlreichen Studien mit unterschiedlichen Fragestellungen verwendet, von denen wir im Folgenden einige herausstellen.

2011 wurde an einigen Freiwilligen der Einfluss ausgedehnten Fastens auf einen Zeitraum von bis zu 36 Stunden untersucht [67]. NMR-Spektren von Blut und Urin lieferten dabei neben anderen Analysen wertvolle Informationen über fastenbedingte Änderungen der Metabolite. Insgesamt wurden in dieser Studie neben den bekannten Markern wie Fettsäuren, Glycerin und Ketokörpern einige neue Biomarker identifiziert. Dazu gehörten α-Aminobutyrat und andere Amino- und Ketosäuren. Erst kürzlich wurde dieser Ansatz in erweiterter Form untersucht [68]. 15 junge, gesunde männliche Freiwillige unterzogen sich einem genau kontrollierten Programm, bestehend aus 36 Stunden Fasten, spezieller Flüssignahrung, Sport, Kälte und zahlreichen Tests (Glukosetoleranztest, Lipidtest, Haarproben, Blut-, Urin- und Atemluftuntersuchungen). Mittels Massenspektroskopie und NMR-Analysen wurden unter 275 Metaboliten – insbesondere Lipide und Aminosäuren – die Metabolite identifiziert, die eine hohe positive Korrelation in ihrem zeitlichen Verlauf zeigten, so z.B. die vorhandene Menge an Chylomikronen und VLDL (r=0,9, NMR), aber auch solche, die eine starke negative Korrelation aufwiesen, wie Carnitin und Acylcarnitin (r=–0,66, MS) als beste Indikatoren für katabolische und anabolische Bedingungen.

Der Einfluss spezieller Nahrung auf das Stoffwechselmuster wurde auch in einer Studie zur Gewichtsreduktion untersucht [69]. Dazu wurden 3 Versuchsgruppen aus jeweils 31 Frauen über 24 Wochen entweder ω-3-Fischöl verabreicht oder ein Placebo. Zusätzlich absolvierten zwei der drei Gruppen über 12 Wochen ein Gewichtsreduktionsprogramm. Bei Probanden, die Fischöl und keine Placebos bekamen, wurde unabhängig vom Gewichtsverlust eine spezifische Änderung im Lipid-Profil diagnostiziert, die durch eine Erhöhung von PL und eine Reduktion bestimmter TG erklärt wurde.

Die NMR-spektroskopische Analyse des LP-Profils kombiniert mit kleinen Metaboliten wurde insbesondere auch zur verbesserten Risikobewertung von Krankheiten verwendet [70]. An 1595 Studienteilnehmern zwischen 24 und 39 Jahren wurde im Rahmen der Cardiovascular Risk in Young Finns Study zu Beginn und nach einem Zeitraum von sechs Jahren die Interna-Media-Dicke bestimmt und mit den entsprechenden Blutwerten korreliert. Die besten Vorhersagen konnten anhand der Konzentration von LDL-Cholesterin, durchschnittlich großem HDL und verschiedenen Metaboliten wie Tyrosin und Glutamin – alles mit NMR bestimmt – getroffen werden.

Ähnliche Modelle wurden auch zur Früherkennung von Diabetes und deren typischen Folgekrankheiten diskutiert. In einer Studie an 182 Typ-1-Diabetikern und 21 gesunden Probanden konnte eine klare Unterscheidung zwischen den beiden Gruppen getroffen werden, die einzig auf einem abweichenden Muster der ¹H-NMR-Spektren basierte. Außerdem wurde die Vorhersagegenauigkeit für Nephropathie untersucht und mit biochemischen Werten verglichen. Die Sensitivität der NMR-Daten war mit 87,1% (Referenz: 83,9%) etwas besser als die Referenzwerte, die Spezifität war mit 87,7% (Referenz: 95,9%) etwas schlechter [71]. Eine weitere Untersuchung basierte auf 613 Teilnehmern mit Typ-1-Diabetes, die ein breites Spektrum an Komplikationen wie Nephropathie, Insulinresistenz und Metabolisches Syndrom aufwiesen. Diese lieferte ebenfalls vielversprechende Ergebnisse [72].

In einer Hypertonie-Studie wurden NMR-spektroskopische Serum-Analysen herangezogen, um typische Veränderungen in Gruppen unterschiedlicher Schweregrade zu untersuchen [73]. Über chemometrische Methoden in Kombination mit ¹H-NMR-Spektren konnten 28 Probanden mit normalem Blutdruck effektiv von solchen mit leicht (19 Probanden) oder stark erhöhtem Blutdruck (17 Probanden) separiert werden.

Metabolomics auf Basis der NMR-Spektroskopie wurde insbesondere in der Krebsforschung erfolgreich untersucht. So konnten in einer Studie aus 36 Leberzirrhose-Patienten und 39 an Leberzellkarzinom erkrankten einerseits ein eindeutig erhöhter Spiegel an z.B. Acetat, N-Acetylglycoproteinen, Pyruvat und Glutamin und auf der anderen Seite verminderte Werte von Isoleucin, Valin oder Acetoacetat gefunden werden [74]. Bei Mundhöhlenkarzinomen war nicht nur eine Unterscheidung von gesunden zu erkrankten Patienten, sondern auch eine Differenzierung der Schweregrade der Krankheit möglich [75]. Unterschiedliche Konzentrationen von Aminosäuren und Zuckern ließen auf einen gestörten Energiestoffwechsel schließen, d.h. Lipolyse, Krebszyklus und Aminosäure-Abbau. In einer Studie an 103 Patienten mit kolorektalem Adenokarzinom – davon 42 mit lokoregionärem Karzinom, 45 mit Lebermetastasen und 25 auch mit extrahepatischen Metastasen – konnte man außerdem eindeutig zwischen den verschiedenen Gruppen mittels NMR-Spektroskopie oder Gaschromatographie unterscheiden [76]. Diese Ergebnisse zeigen die universelle Einsetzbarkeit der NMR in der Krebsforschung, was zu neuen Erkenntnissen über gestörte Stoffwechselprozesse führt. Zukünftig wird eine Früherkennung solcher Krankheiten möglicherweise schon sehr viel genauer und schneller über spezielle Signalmuster im Blut möglich sein.