High-resolution microscopy of biofilm and bacteria on titanium implants

1 Introduction

Biofilm is described as a “3D structure that acts as a microbial battlefront” by the American Academy of Microbiology and is considered one of the most adaptable microbial features in nature. It can be found on different surfaces such as rocks (slime), water pipes and plant roots. When the associated microbes are pathogenic, biofilm-mediated infections can arise in the human body [1]. These infections may be caused by bacteria coming from surgical instruments or even from pre-existing germs within the patient’s body and they are resistant to conventional antibiotic treatment. Therefore, over the last years efforts were concentrated to understand and characterize biofilms to develop new therapies.

The formation of biofilm involves multiple steps as it is documented in the literature [2].

The characterization of biofilms can be distinguished by quantitative – i. e., counting methods – and qualitative analysis techniques. The latter comprise, among others, scanning electron microscopy (SEM), which enhances the collection of high-resolution images [3]. A constraint of the SEM equipment which operates under high vacuum is the necessity of extensive specimen preparation for biological samples including fixation, removal of moisture, and coating to ensure electrical conductivity. The drawback of dehydration is the risk of collapse of the structure, contraction and/or loss of substance. The two main methods for the preparation of cells and tissue for SEM analysis described in the scientific literature are cryofixation and chemical fixation. The former consists of cryoimmobilization, freeze-fracturing, partial freeze-drying, coating and analysis via a cryo-SEM. The latter includes chemical fixation, dehydration and the use of CO₂ or critical point-drying prior to coating [4].

The available literature about chemical fixation of biofilm documents multiple approaches for the dehydration process. In the work of Arnold and Bailey [5], stainless steel disks were fixed for 2 h in 2 % glutaraldehyde and 2 % paraformaldehyde in sodium cacodylate buffer. After rinsing in cacodylate buffer, the samples were dehydrated in 50 to 100 % ethanol and critical point-dried. Afterwards, the disks were mounted on aluminum stubs and sputter-coated with gold-palladium.

The Harvard Medical School suggests a similar routine including post-fixation with 1 % Osmium tetroxide in water as protocol for a SEM investigation [6].

Abar et al. [7] studied laboratory cell culture discs of Ti-6Al-4V ELI after washing them twice with phosphate-buffered saline (PBS) for 10 min each. Samples were then dehydrated with increasing ethanol concentrations, washed 3 times in the respective concentrations and rinsed 3 times with hexamethyldisilazane prior to letting the reagent evaporate in the chemical fume hood. Subsequently the samples were sputter-coated and analyzed with a scanning electron microscope.

Agarwal et al. [8] used 3 % glutaraldehyde solution for the fixation process, followed by gold sputter coating. However, they did not mention any dehydration after the fixation in their study.

The objective of this work was to implement a fixation method to simplify the specimen preparation procedure prior to the analysis of biofilm and bacteria on implants using high-resolution SEM. The goal was to create a routine which enables experienced and well-equipped laboratories to analyze implants to open research on biofilm to future applications and studies and to gain comparability/standardization regarding implant-associated biofilms under real-world conditions. The starting point for the development of a new fixation and dehydratation procedure was the review of the current methods described in the literature and the formulation of a modified protocol without the need for critical point-drying or the use of multiple different buffers and solutions. The study was performed on four pedicle screws and a connecting rod from revision spine surgery. The patients did not suffer from any clinical infection at the time of surgery.

2 Material and methods

After surgical explantation, the implants were rinsed directly in the operating room with physiological saline solution to remove typical contaminants and stored in a dedicated container to transport the samples from the hospital to the laboratory. The aim of the container was to immobilize the implants so that the surfaces to be analyzed did not touch the inside of the container thereby minimizing biofilm disruption and exogenous contamination during transport and prior to fixation. Once the implants reached the laboratory, the fixation process was immediately started.

Each implant was fixed with 2.5 % glutaraldehyde solution at room temperature. Subsequently, the samples were dehydrated with increasing concentrations of ethanol. Each screw was treated separately and a series of DURAN^® laboratory glasses (DWK Life Sciences GmbH, Wertheim, Germany) were used for immersion in the different solutions. Table 1 summarizes the concentrations and time periods used for fixation.

Afterwards, the specimens were dried with a hairdryer for 2–3 seconds at minimum power and heat settings and at 20 cm distance from the nozzle to avoid overheating and potential detaching of material from the implant surface. The samples were stored in a desiccator (Glaswerk Wertheim, Wertheim, Germany) for 1 day to ensure complete evaporation of the ethanol. The dried specimens were finally mounted on aluminum stubs and coated with gold-palladium for 120 s using a sputter coater (Polaron Emitech SC7640, Bad Schwalbach, Germany). The implants were analyzed with a scanning electron microscope (Zeiss Supra VP Feld Emission, Oberkochen, Germany) operated at 20 kV. For the handling of the implants, laboratory gloves as well as clamping tongs were used at areas far away from the region of interest (e. g., the thread of the screws).

3 Results

Each pedicle screw was analyzed and images with different magnifications were recorded. Figures 1 to 6 display representative examples of the observations. The crests as well as the threads and the tips of the pedicle screws were partially covered by different types of structures. Figures 1 and 2 depict subsequently magnified images taken from different areas of the implants showing an amorphous film identified as biofilm. Under the matrix, the shape of bacteria and erythrocytes can be perceived. Figures 3 and 4 show close-ups of erythrocytes and fibrin network. Due to their appearance and shape, the bacteria documented in Figures 5 and 6 are classified as Staphylococcus. The fimbriae for the attachment of the bacteria at the surface are clearly recognizable. Moreover, some bacteria are partially or completely covered by the matrix.

Fig. 1a to c

SEM of a surgically explanted pedicle screw after fixation. Magnifications: a) 25-fold; b) 200-fold; c) 1500-fold. c) Shows bacteria covered by biofilm.

Bild 1a bis c REM einer chirurgisch explantierten Pedikelschraube nach der Fixierung. Vergrößerungen: a) 25-fach; b) 200-fach; c) 1500-fach; c) zeigt von Biofilm bedeckte Bakterien.

Fig. 2a and b

SEM of a surgically explanted connecting rod after fixation showing biofilm. Magnifications: a) 1500-fold; b) 3500-fold.

Bild 2a und b REM einer chirurgisch explantierten Verbindungsstange nach der Fixierung mit einem Biofilm. Vergrößerungen: a) 1500-fach; b) 3500-fach.

Fig. 3a and b

Erythrocytes at the surface of a pedicle screw. Magnifications: a) 3500-fold; b) 8000-fold.

Bilder 3a und b Erythrozyten an der Oberfläche einer Pedikelschraube. Vergrößerungen: a) 3500-fach; b) 8000-fach.

Fig. 4

Fibrin network at the surface of a pedicle screw. Magnification: 15000-fold.

Bild 4 Fibrinnetz an der Oberfläche einer Pedikelschraube. Vergrößerung: 15000-fach.

Fig. 5

Staphylococci with fimbriae and biofilm. The bacterium on the bottom right is covered by a film which extends up to the bacterium in the middle of the picture. Magnification: 2000-fold.

Bild 5 Staphylokokken mit Fimbrien und Biofilm. Das Bakterium rechts unten ist von einem Film überzogen, der bis zum Bakterium in der Bildmitte reicht. Vergrößerung: 2000-fach.

Fig. 6

Colony of Staphylococci partially covered by a matrix (arrows). Magnification: 2500-fold.

Bild 6 Teilweise von einer Matrix bedeckte Staphylokokken-Kolonie (Pfeile). Vergrößerung: 2500-fach.

4 Discussion

The formation mechanisms and the implications of biofilms on human implants are of a great interest, and many in vitro studies have been carried out to analyze biofilms using different fixation protocols. In this study, surgically removed implants were analyzed applying a novel simplified but effective fixation protocol. The results show isolated bacteria as well as bacteria covered by biofilm. The observed bacteria are attached to the implant surfaces and held together by a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) defined as biofilm [9]. The high-resolution SEM recordings provide detailed views of the 3D biofilm structure and the amorphous characteristic of the matrix. Blood cells as well as the bacteria with their associated matrix did not cover the entire lengths of the implants but were rather randomly distributed along the pedicle screws and the connecting rod. Compared to the biofilm images of in vitro tests published elsewhere [10], which predominantly reported different types of bacteria with barely recognizable associated matrix, the biofilm covering the bacteria on the implants in the present high-resolution study is clearly discernable. Moreover, the obtained results demonstrate fully developed biofilms totally covering the bacteria as well as very fine structures attaching the bacteria to the implant surfaces, i. e., the early stages of biofilm formation.

5 Conclusion

This study demonstrates the feasibility to capture high-resolution SEM images of biofilm as well as of bacteria and blood cells on ex-situ implants using a simplified chemical fixation method. The main challenge of the examination of implants lies in the careful preparation in order to maintain the information present at the sample surface and at the same time to achieve sufficient vacuum conditions for optimal image resolution. These challenges do not lie in the observation and capturing of images with the SEM itself, but in the lack of standardized protocols for preparation and characterization of the samples. With the simplified fixation protocol proposed in this article, it is possible to detect the presence of biofilm on titanium implants via high-vacuum SEM in combination with the methods typically established in a fully equipped metallography laboratory.

1 Einleitung

Ein Biofilm wird von der American Academy of Microbiology als „3D-Struktur“ beschrieben, „die als mikrobielle Kampffront fungiert“ und wird als eine der anpassungsfähigsten mikrobiellen Strukturen der Natur angesehen. Man findet ihn auf verschiedenen Oberflächen, beispielsweise auf Steinen (Schleim), Wasserleitungen und Wurzeln von Pflanzen. Sind die damit einhergehenden Mikroben pathogen, können im menschlichen Körper biofilm-vermittelte Infektionen auftreten [1]. Solche Infektionen können von Bakterien verursacht werden, die von chirurgischen Instrumenten stammen, oder sogar durch bereits im Körper des Patienten vorhandene Keime, und sind resistent gegenüber herkömmlichen Antibiotikabehandlungen. In den letzten Jahren konzentrierten sich Arbeiten auf das Verständnis und die Charakterisierung von Biofilmen mit dem Ziel der Entwicklung neuer Therapien.

In der Literatur ist dokumentiert, dass sich ein Biofilm in mehreren Schritten ausbildet [2]. Bei der Charakterisierung von Biofilmen kann zwischen quantitativen, d. h. Zählverfahren, und qualitativen Analyseverfahren unterschieden werden. Zu letzteren gehört unter anderem die Rasterelektronenmikroskopie (REM). Sie ermöglicht die Erfassung hochauflösender Bilder [3]. Kehrseite eines REM-Hochvakuum-Mikroskops ist die Notwendigkeit einer aufwändigen Präparation der biologischen Proben einschließlich Fixierung, Beseitigung von Feuchtigkeit und Beschichtung zur Gewährleistung der elektrischen Leitfähigkeit. Nachteil der Dehydratation ist die Gefahr, dass Strukturen zusammenbrechen, sich zusammenziehen und/oder an Substanz verlieren. Die beiden wichtigsten in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Verfahren zur Präparation von Zellen und Gewebe für die REM-Analyse sind die Kryofixierung und die chemische Fixierung. Erstere umfasst folgende Schritte: Kryo-Immobilisierung, Gefrierbruch, partielle Gefriertrocknung, Beschichtung und Analyse mittels eines Kryo-REM. Letztere umfasst die chemische Fixierung, Dehydratation und Verwendung von CO₂ oder Kritische-Punkt-Trocknung vor der Beschichtung [4].

In der bezüglich der chemischen Fixierung von Biofilmen verfügbaren Literatur sind mehrere Ansätze für den Dehydratationsprozess dokumentiert. In der Arbeit von Arnold und Bailey [5] wurden Edelstahlscheiben zwei Stunden lang in 2 %igem Glutaraldehyd und 2 %igem Paraformaldehyd in einem Natriumcacodylat-Puffer fixiert. Nach dem Spülen im Cacodylat-Puffer wurden die Proben in 50 bis 100 % Ethanol dehydratisiert und kritischpunkt-getrocknet. Anschließend wurden die Scheiben auf Aluminiumprobenträger montiert und Gold/Palladium aufgesputtert.

Die Harvard Medical School empfiehlt eine ähnliche Routine einschließlich einer Nachfixierung mit 1 % Osmiumtetroxid in Wasser als Protokoll für eine REM-Untersuchung [6].

Abar et al. [7] untersuchten Labor-Zellkulturscheiben aus Ti-6Al-4V ELI nach zweimaligem 10-minütigen Reinigen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Proben wurden anschließend mit steigenden Ethanolkonzentrationen dehydriert, dreimal in den entsprechenden Konzentrationen gereinigt und dreimal mit Hexamethyldisilazan gespült, bevor sich das Reagens im Chemikalien-Laborabzug verflüchtigen konnte. Anschließend wurden die Proben besputtert und mit einem Rasterelektronenmikroskop analysiert.

Agarwal et al. [8] arbeiteten zum Fixieren vor dem Aufsputtern mit einer 3 %igen Glutaraldehydlösung. In ihrer Untersuchung erwähnten sie jedoch keine nach der Fixierung erfolgende Dehydratation.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Realisierung eines Fixierverfahrens zur Vereinfachung der Probenpräparation vor der Analyse von Biofilmen und Bakterien auf Implantaten mittels hochauflösender Rasterelektronenmikroskopie. Es sollte eine Routine entwickelt werden, die erfahrenen und gut ausgestatteten Laboren die Möglichkeit der Untersuchung von Implantaten bietet, der Biofilmforschung so der Weg für zukünftige Anwendungen und Untersuchungen bereitet sowie Vergleichbarkeit/Standardisierung hinsichtlich implantat-assoziierter Biofilme unter realen Bedingungen gewährleistet werden. Ausgangspunkt für die Entwicklung eines neuen Fixier- und Dehydratationsverfahrens war die Auswertung der in der Literatur beschriebenen aktuellen Verfahren und die Ausarbeitung eines modifizierten Protokolls, das ohne eine Kritische-Punkt-Trocknung oder den Einsatz mehrerer verschiedener Puffer und Lösungen auskommt. Die Untersuchung wurde an vier aus einer Revisionsoperation an der Wirbelsäule stammenden Pedikelschrauben sowie einer Verbindungsstange durchgeführt. Die Patienten litten zum Zeitpunkt der Operation nicht an einer klinischen Infektion.

2 Werkstoff und Verfahren

Nach der chirurgischen Explantation wurden die Implantate zur Entfernung typischer Verunreinigungen direkt im OP mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und in einem speziellen Behälter vom Krankenhaus ins Labor transportiert. Der Behälter diente dazu, die Implantate so zu fixieren, dass die zu untersuchenden Oberflächen nicht die Innenseite des Behälters berühren, um so das Risiko eines Risses des Biofilms und einer exogenen Kontamination während des Transports sowie vor der Fixierung zu minimieren. Unmittelbar nach der Ankunft der Implantate im Labor wurde mit dem Fixierungsprozess begonnen.

Die einzelnen Implantate wurden bei Raumtemperatur mit einer 2,5 %igen Glutaraldehydlösung fixiert. Anschließend wurden die Proben mit steigenden Ethanolkonzentrationen dehydriert. Dabei wurde jede Schraube separat behandelt. Zum Eintauchen in die verschiedenen Lösungen diente eine Reihe von DURAN^®-Laborgläsern (DWK Life Sciences GmbH, Wertheim, Deutschland). Tabelle 1 fasst die zur Fixierung gewählten Konzentrationen und Zeiten zusammen.

Anschließend wurden die Proben zur Vermeidung einer Überhitzung und einer etwaigen Ablösung von Material von der Oberfläche des Implantats mit einem auf geringster Leistungs- und Wärmestufe eingestellten Föhn in einem Abstand von 20 cm von der Düse 2 bis 3 Sekunden lang getrocknet. Die Proben wurden zur Gewährleistung einer vollständigen Verdunstung des Ethanols einen Tag lang in einem Exsikkator (Glaswerk Wertheim, Wertheim, Deutschland) gelagert. Die getrockneten Proben wurden schließlich auf Aluminiumträger montiert und mithilfe einer Sputter-Beschichtungsanlage (Polaron Emitech SC7640, Bad Schwalbach, Deutschland) 120 s lang mit Gold/Palladium beschichtet. Die Implantate wurden mit einem mit 20 kV betriebenen Feldemissionsrasterelektronenmikroskop (Zeiss Supra VP, Oberkochen, Deutschland) untersucht. An Stellen, die weit vom Bereich von Interesse entfernt lagen (z. B. dem Gewinde der Schrauben) wurden zur Handhabung der Implantate Laborhandschuhe sowie Klemmzangen verwendet.

3 Ergebnisse

Die einzelnen Pedikelschrauben wurden untersucht und Bilder mit unterschiedlichen Vergrößerungen aufgenommen. Die Bilder 1 bis 6 zeigen repräsentative Beispiele der Beobachtungen. Sowohl die Gewindespitzen als auch die Gewinde und Spitzen der Pedikelschrauben waren teilweise von unterschiedlichen Strukturen bedeckt. Die Bilder 1 und 2 zeigen vergrößerte Aufnahmen verschiedener Bereiche der Implantate, die einen amorphen Film aufweisen, der als Biofilm identifiziert wurde. Unter der Matrix sind Konturen von Bakterien und Erythrozyten zu erkennen. Die Bilder 3 und 4 zeigen hochauflösende Aufnahmen von Erythrozyten und einem Fibrinnetz. Aufgrund ihres Aussehens und ihrer Form werden die in den Bildern 5 und 6 dargestellten Bakterien als Staphylococcus klassifiziert. Die Fimbrien, die dafür sorgen, dass die Bakterien an der Oberfläche anhaften, sind deutlich erkennbar. Darüber hinaus sind einige Bakterien teilweise oder vollständig von der Matrix bedeckt.

4 Diskussion

Die Bildungsmechanismen und Auswirkungen von Biofilmen auf Humanimplantate sind von großem Interesse, und zur Untersuchung von Biofilmen wurden unter Anwendung verschiedener Fixierungsprotokolle zahlreiche Invitro-Studien durchgeführt. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden chirurgisch entfernte Implantate unter Anwendung eines neuen vereinfachten, aber effizienten Fixierungsprotokolls analysiert. Dabei konnten isolierte Bakterien sowie von einem Biofilm bedeckte Bakterien beobachtet werden. Die entsprechenden Bakterien haften an den Implantatoberflächen an und werden durch eine Matrix aus als Biofilm definierten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) zusammengehalten [9]. Die hochauflösenden REM-Aufnahmen bieten detaillierte Einblicke in die 3D-Biofilmstruktur und die amorphe Ausprägung der Matrix. Blutzellen sowie die Bakterien mit ihrer entsprechenden Matrix bedeckten die Implantate nicht über ihre gesamte Länge, sondern waren eher zufällig entlang der Pedikelschrauben und der Verbindungsstange verteilt. Im Gegensatz zu Biofilmaufnahmen von an anderer Stelle veröffentlichten In-vitro-Tests [10], im Rahmen derer überwiegend von verschiedenen Bakterienarten mit kaum wahrnehmbarer zugehöriger Matrix berichtet wurde, ist der Biofilm, der die Bakterien auf den Implantaten in der vorliegenden hochauflösenden Untersuchung bedeckt, deutlich erkennbar. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse voll entwickelte, die Bakterien vollständig bedeckende Biofilme sowie sehr feine Strukturen, mit denen die Bakterien an der Implantatoberfläche anhaften, also frühe Phasen der Biofilmbildung.

5 Schlussfolgerung

Diese Untersuchung zeigt, dass es mithilfe einer vereinfachten chemischen Fixierungsmethode möglich ist, hochauflösende REM-Aufnahmen eines Biofilms sowie von Bakterien und Blutzellen auf Ex-situ-Implantaten zu erhalten. Die größte Herausforderung bei der Untersuchung von Implantaten besteht in einer sorgfältigen Präparation, die gewährleistet, dass an der Probenoberfläche vorhandene Informationen erhalten bleiben und gleichzeitig die für eine optimale Bildauflösung erforderlichen Vakuumbedingungen erreicht werden. Die Herausforderung liegt dabei nicht in der Betrachtung und Aufnahme von Bildern mit dem REM selbst, sondern im Fehlen von standardisierten Protokollen für die Probenpräparation und -charakterisierung. Mit dem in dieser Arbeit vorgeschlagenen vereinfachten Fixierungsprotokoll kann das Vorhandensein eines Biofilms auf Titanimplantaten mittels Hochvakuum-REM in Kombination mit den Verfahren nachgewiesen werden, die in einem voll ausgestatteten Metallographielabor in der Regel etabliert sind.