Caracterización genómica de los mecanismos de adaptación de Pseudomonas aeruginosa en pacientes con bronquiectasias

Introducción

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista responsable de las causas más frecuentes de infección nosocomial y afecta en mayor medida a los pacientes inmunodeprimidos. Asimismo, P. aeruginosa es uno de los principales agentes causantes de la infección bronquial crónica (IBC)que contribuye a la morbimortalidad de los pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, como la fibrosis quística (FQ), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o las bronquiectasias (BQ) [1].

Las BQ se caracterizan por la dilatación permanente y destrucción gradual de las paredes bronquiales, como resultado de diversas patologías sistémicas o localizadas [2].

Los estudios que abordan la caracterización genómica de P. aeruginosa en pacientes con BQ son muy escasos [3] y la mayoría de los publicados hasta la fecha se centran en los mecanismos de resistencia a los antibióticos [4].

El objetivo del presente estudio es determinar la sensibilidad antibiótica de 100 aislados de P. aeruginosa obtenidos de 100 pacientes con BQ no debida a FQ , así como caracterizar otros mecanismos genéticos de tipo adaptativo diferentes a los de la resistencia antibiótica, que contribuyen a la persistencia de este patógeno en la IBC.

Materiales y métodos

Resultados

En la Figura 1 se muestran los porcentajes de sensibilidad antimicrobiana de los 100 aislados de P. aeruginosa.

Figura 1:

Sensibilidad antibiótica (%) en la colección de P. aeruginosa-BQ. CIP, ciprofloxacino; TOB, tobramicina; TZP, piperacilina/tazobactam; FEP, cefepime; ATM, aztreonam; CAZ, ceftazidima; IPM, imipenem; MEM, meropenem; AMK, amikacina; CST, colistina.

El antimicrobiano con menor tasa de sensibilidad fue ciprofloxacino, mientras que la colistina, la amikacina y los carbapenémicos fueron los compuestos con mayor actividad. La mayoría de los aislados secuenciados se identificaron como hipersensibles a casi la totalidad de los antibióticos testados, salvo siete aislados que se identificaron como multirresistentes (MDR). Estos aislados MDR se indican en la Tabla 1, donde se detalla el antibiograma de todos los aislados secuenciados.

Para la caracterización de los mecanismos de adaptabilidad, se realizó el análisis de VC en los 55 aislados secuenciados, con el objeto de identificar mutaciones de pérdida de función (loss-of-function mutations).

En la Tabla 2 se muestran los ST y las mutaciones de pérdida de función identificadas en los diferentes genes asociados a la adaptabilidad de P. aeruginosa al ambiente pulmonar crónico.

Entre los 55 aislados secuenciados, el ST más frecuente fue el ST253 (7), seguido de ST395 (3). Siete aislados mostraron una combinación de alelos desconocida, por lo que no se pudieron asignar a ninguno de los secuenciotipos actualmente descritos. Los clones de alto riesgo más frecuentes fueron ST175 (1), ST235 (1), ST244 (1) y ST357 (1), presentando los tres últimos un perfil noMDR. Otros clones de alto riesgo con perfiles no MDR fueron ST17, ST274, y ST532, cada uno de ellos representados por un único aislado.

Las mutaciones de pérdida de función más frecuentes se detectaron en los genes que codifican los tres componentes de la bomba de expulsión MexAB-OprM, detectándose mutaciones en al menos uno de estos genes en 27 aislados.

El hallazgo de aislados con altas tasas de hipermutación es frecuente en infecciones crónicas de P. aeruginosa y se debe a la pérdida de función de los genes de reparación del ADN por mecanismo de emparejamieto de bases, mutS y mutL.En esta cohorte, se identificaron 5 aislados que presentaban mutaciones truncantes en estos genes.

Con respecto al fenotipo mucoide, 17 aislados presentaron mutaciones de pérdida de función en mucA, y solo uno en mucB. De estos, 10 mostraron un fenotipo mucoide (BQ04-05-06-07-08-41-42-44-46-52). Estos genes codifican proteínas que inhiben la actividad del factor sigma AlgU, que desempeña un papel crucial en la hiperproducción de alginato y la formación de biofilms.

La herramienta IGV se empleó para detectar grandes deleciones en el genoma de P. aeruginosa. Así, se analizaron grandes edeleciones en los clusteres pel, alg y pel, con funciones todos ellos en la formación de biofilms, así como en los genes relacionados con la síntesis de pioverdina (pvdABCoperon) y su receptor fpvA, ambos implicados en la adquisición de hierro.

En 10 de estos aislados, se detectó la deleción total de dos o más genes del clúster psl, con tamaños que oscilaban entre 1,8 y 278 kb, mientras que los clusteres alg y pel permanecieron intactos en la totalidad de los aislados.

Con respecto a la formación de biofilms, también se analizaron los genes bifA, rbdA, oprF y ladS mediante análisis tipo VC.

No se detectaron mutaciones en bifA, que codifica una fosfodiesterasa de c-di-GMP que estimula la motilidad en superficie (tipo swarming), en detrimento de la formación de biofilms. Por otro lado, RbdA, otra fosfodiesterasa con actividad en la degradación de c-di-GMP, presentó mutaciones de pérdida de función en 12 aislados. Del mismo modo, OprF, la porina predominante de la membrana externa de P. aeruginosa, presentó mutaciones de pérdida de función en tres aislados. LadS, induce la expresión de genes relacionados con la producción de exopolisacáridos asociados a la formación de biofilms, incluidos Pel y alginato, así como una amplia variedad de factores de virulencia, como los genes con efectos en la motilidad y la expresión del sistema de secreción de tipo III (T3SS). En este estudio, siete aislados presentaron mutaciones truncantes en ladS.

Con respecto a la caracterización de la síntesis de pioverdina y su receptor fpvA, todos los aislados a excepción de BQ02-06-07-12-22-25-30-32-42-43-44-45-48-50-51-52 presentaron uno o más genes delecionados del clúster pvd y/o gen fpvA (información no incluida en la Tabla 2).

Otras mutaciones de pérdida de función en genes como pilJ, chpA y fimV están relacionadas con la motilidad tipo twitching, y podrían ser una adaptación al ambiente viscoso del esputo. En el presente estudio, dos aislados presentaron mutaciones truncantes en pilJ, 24 en chpA, y 23 en fimV. En la Tabla 2 no se muestran las mutaciones concretas en chpA y fimV, pues son múltiples y de tipo pérdida de función.

Discusión

Los resultados obtenidos indican que, a diferencia de otras infecciones respiratorias crónicas, en este conjunto de aislados de P. aeruginosa causantes de BQ, las tasas de resistencia antibiótica no son particularmente altas. Este escenario brinda la oportunidad única de explorar otros mecanismos de adaptación genética, diferentes de los de resistencia atibiótica, que facilitenn la persistencia de este patógeno en la IBC.

La distribución de los ST refleja la variabilidad genética en la población global de P. aeruginosa. La identificación de seis aislados no atribuibles a un ST conocido indica que esta población se encuentra en constante evolución genética. Así mismo, la detección de clones de alto riesgo, como ST175, ST235, ST244, y ST357, la mayoría vinculados a perfiles no MDR, evidencia la intrincada dinámica de la diseminación de estos clones y sus posibles efectos sobre el tratamiento de la infección y las estrategias terapéuticas [7].

Con respecto a los mecanismos de adaptación de P. aeruginosa al ambiente crónico pulmonar, el análisis del genoma de los 55 aislados seleccionados reveló una serie de adaptaciones genéticas significativas que facilitan la persistencia de este patógeno en pacientes con BQ.

El mayor número de mutaciones de pérdida de función se observó en la bomba de expulsión MexAB-OprM, que desempeña un papel fundametal en la resistencia basal a la mayoría de los β-lactámicos, incluidas las nuevas combinaciones de inhibidores de beta-lactámicos/beta-lactamasas. Este hallazgo explica el perfil de hipersensibilidad de estos aislados a estos antibióticos. Además, MexAB-OprM se ha asociado con la virulencia, ya que mutantes deficientes en esta bomba muestran una menor capacidad invasiva. Esto sugiere que las mutaciones truncantes observadas podrían deberse a mecanismos distintos a los relacionados con la resistencia a antibióticos [8].

Con respecto a la formación de biofilms la deleción de genes en el clúster psl, unida a la integridad de los clusteres alg y pel, indica que, en este conjunto de aislados, la formación de biofilms se basa principalmente en los polisacáridos Pel y alginato, en lugar de en Psl [9].

Así mismo, la elevada prevalencia de mutaciones truncantes en el gen mucA subraya la importancia de la hiperproducción de alginato en el desarrollo del fenotipo mucoide, un rasgo que determina la virulencia y resistencia de P. aeruginosa en las infecciones crónicas [10]. También se ha demostrado que las alteraciones en RbdA y OprF provocan una elevación de los niveles c-di-GMP, lo que deriva en una mayor formación de biofilm a través de la hiperproducción de Pel [9], 11].

Las mutaciones en LadS mejoran la motilidad y actividad de T3SS, en detrimento de la producción de biofilm de Pel y alginato [12]. Cabe mencionar que uno de los cuatro aislados portadores de una mutación de pérdida de función en este gen también presentaba deleción completa de los genes pslB y pslC, lo que indica que la formación de biofilm podría estar notablemente afectada en este aislado.

Por otro lado, la frecuente deleción de genes asociados a la síntesis de pioverdina y de su receptor FpvA indica que P. aeruginosa se adapta al huésped favoreciendo rutas alternativas de adquisición de hierro, como podría ser a través del grupo hemo de las proteínas del huésped [13].

Finalmente, se observó un elevado número de mutaciones de pérdida de función en genes asociados a la motilidad tipo twitching como pilJ, chpA y fimV. Estas mutaciones se asocian con una motilidad modificada, un fenotipo que se observa también en la FQ, y podría tratarse de una adaptación a la viscosidad del ambiente del esputo [3], 13].

Estos hallazgos genómicos resultan de gran relevancia para mejorar las estrategias terapéuticas en elmanejo de las bronquiectasias.

La deleción de la bomba de expulsión mexAB aumenta la sensibilidad a los β-lactámicos, por lo que si se conoce este hallazgo, pueden diseñarse terapias antimicrobianas más específicas[8]; asimismo la reducción de la biosíntesis de pioverdina indica un cambio en la captación de hierro,evidenciando así el potencial de las terapias de quelación de hierro para interferir en su metabolismo y en la formación de biopelículas.

Además, dada la rapidez con la que P. aeruginosa ha desarollado resistencia a los antibióticos, limitando así la eficacia de estos a largo plazo, se están investigando tratamientos no antibióticos, como la terapia con fagos [14], los inhibidores de quorum sensing y las terapias basadas en nanopartículas [15], como tratamientos alternativos a las terapias tradicionales o bien como adyuvantes.

En conclusión, la caracterización genómica de P. aeruginosa resulta esencial para identificar los mecanismos que permiten su adaptación al ambiente pulmonar crónico y facilitar el desarrollo de terapias alternativas que minimicen la estrategia de “prueba y error” que se sigue aplicando actualmente.