Optimización de un método de cribado rápido de fármacos en sangre mediante la técnica de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas

Introducción

La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas ha ganado en popularidad en los laboratorios clínicos en los últimos 10–15 años [1, 2]. El aumento de su utilidad probablemente se deba a su mayor especificidad como técnica analítica, la posibilidad de determinar múltiples analitos en una sola inyección de la muestra, la medición de analitos en una variedad de matrices diferentes y a una drástica reducción de las interferencias analíticas en comparación con el inmunoensayo [3]. Sin embargo, el inmunoensayo todavía se utiliza habitualmente en muchos laboratorios como prueba de cribado de primera línea, si bien cualquier resultado positivo debe ser confirmado por un segundo método basado en la cromatografía acoplada a la espectrometría de masas [4].

En el ámbito de la toxicología clínica y forense, los compuestos a determinar no se conocen a priori. Los inmunoensayos son insuficientes para el estudio de estos casos, ya que están diseñados para el análisis de un número limitado de las sustancias que pueden estar implicadas (o de familias de sustancias) y carecen de la sensibilidad y selectividad necesarias. Por tanto, es necesario aplicar estrategias analíticas de mayor eficacia (Análisis Toxicológico Sistemático, STA) para hacer posible la identificación de cientos de sustancias tóxicas relevantes en muestras biológicas y asegurar así una correcta interpretación de los resultados [5]. Esta estrategia se estructura en dos etapas. En primer lugar, la realización de un cribado de algunas drogas y fármacos en orina y sangre mediante técnicas de inmunoensayo y, en segundo lugar, la confirmación de los resultados obtenidos en el primer nivel y la realización de un cribado ampliado de sustancias no incluidas en dicho nivel. Las principales técnicas analíticas empleadas son: HS-GC-FID, GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS/MS incluyendo esta última la espectrometría de masas de alta resolución (LC-HR-MS).

El tratamiento y la preparación de las muestras biológicas es un proceso esencial cuando éstas han de ser analizadas mediante sistemas cromatográficos. Su importancia radica en la necesidad de concentrar o eliminar los distintos componentes de la muestra que pueden interferir, y obtener así una apropiada separación y eficacia cromatográficas. A este respecto la finalidad de la preparación de las muestras, o etapa preanalítica, será concentrar las sustancias objeto de estudio, a la vez que eliminar los posibles interferentes endógenos propios de la matriz biológica. La presencia de proteínas, lípidos, sales y componentes celulares pueden interferir en la medición de la magnitud en estudio, así como condicionar el buen funcionamiento del sistema cromatográfico. Los principales procedimientos de preparación de la muestra son la filtración, la centrifugación, la dilución, la precipitación de proteínas, la extracción líquido-líquido (LLE) y la extracción en fase sólida (SPE), siendo estos dos últimos los más habituales en toxicología clínica para el análisis de sangre y orina [6]. Pese a las ventajas que supone la aplicación de estos procedimientos, la mayoría de ellos pueden dar lugar a una pérdida parcial del componente y, por otro lado, no todos permiten eliminar totalmente los diferentes interferentes de la muestra. Se conoce que los principales interferentes en el análisis toxicológico de las muestras de sangre son los fosfolípidos y las proteínas, por lo que los tratamientos deberían centrarse en reducir su presencia al máximo posible. Es por ello por lo que proponemos realizar durante la etapa preanalítica un procedimiento especial de precipitación de proteínas y eliminación de fosfolípidos como método de preparación de muestras de sangre (suero o plasma), en lugar de mediante las extracciones clásicas SPE y LLE [7]. Dicho método presenta varias ventajas. En primer lugar, disminuiría el tiempo de respuesta, ya que es una técnica de duración más corta en el tiempo. En segundo lugar, también tiene la ventaja de favorecer la detección de más componentes que con las técnicas clásicas, ya que es una técnica menos selectiva. En este caso la menor selectividad radica en que analitos de muy diferente naturaleza química y/o polaridad no se eliminan, como sí podría ocurrir en las etapas de SPE y LLE.

El objetivo principal de este estudio es mejorar la sistemática analítica toxicológica en el cribado general de fármacos mediante la técnica LC-MS/MS a través de un nuevo método de preparación de muestras en sangre basado en la precipitación de proteínas y eliminación de fosfolípidos para el cribado de fármacos. Para su análisis se ha evaluado la capacidad de análisis cualitativo, estudiando el límite de detección, la capacidad de análisis cuantitativo, mediante el análisis de los parámetros habituales de caracterización de linealidad, precisión y exactitud para las moléculas seleccionadas. Asimismo, se ha evaluado su aplicabilidad mediante el análisis de once casos de muestras reales recibidas en el INTCF de Madrid. Los resultados han sido comparados con aquellos obtenidos tras las extracciones e instrumentación tradicionales.

Materiales y métodos

Resultados

Los resultados de los LOD, LLOQ y rango de medición de todas las sustancias analizadas por el QTRAP 6500+ se resumen en la Tabla 1. Todas las sustancias expuestas cumplieron con los criterios de aceptación anteriormente descritos.

Respecto a los once casos seleccionados, diez de ellos eran positivos y uno negativo. Se analizaron las once muestras por el nuevo método, resultando seis positivas y cinco negativas debido a que los fármacos de los cuatro casos positivos no detectados (paracetamol, naproxeno, metamizol y benzoilecgonina) no estaban incluidos en nuestro nuevo método. Respecto a los seis casos positivos, se detectaron las mismas sustancias detectadas por la metodología tradicional a excepción de la sertralina del caso 11 y, en contra posición, se detectó lorazepam en el caso 1 por el nuevo método. En cuanto a su cuantificación, se calculó la concentración mediante la recta de calibrado de cada fármaco y utilizando en cada caso el patrón interno más conveniente, tal y como se detalla en la Tabla 1. Los resultados son comparables a excepción de la quetiapina del caso 1 y el diazepam del caso 11. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Discusión

La metodología propuesta de preparación de muestras mediante precipitación de proteínas y eliminación de fosfolípidos y análisis mediante técnicas más sensibles como LC-Q-q-LIT para el cribado de 56 sustancias ha resultado comparable a la metodología tradicional ya que se detectan prácticamente las mismas sustancias por ambas dos. Sin embargo, lo consideramos un estudio preliminar ya que se requiere de un proceso de validación más exhaustivo que incluya la evaluación del rendimiento de extracción, efecto arrastre y efecto matriz para todos los fármacos y patrones internos estudiados y de la realización de más estudios para evaluar la cuantificación de sustancias mediante la metodología propuesta. La principal ventaja que ofrece dicha metodología es la reducción de tiempo y coste ya que con sólo una extracción hemos conseguido detectar los compuestos independientemente de su naturaleza con una elevada sensibilidad y selectividad y en un menor tiempo lo que le confiere una gran ventaja en muestras clínicas, sobre todo.

Los factores limitantes de nuestro estudio han sido la no detección de sertralina y el número de sustancias analizadas, pero lo consideramos un buen punto de partida para su futura implementación sobre todo en muestras procedentes de hospitales como son los casos de sumisión química que requieren de rapidez a la vez que de sensibilidad y especificidad.