Zirkulierende Nukleinsäuren – ein neues Universum in der laboratoriumsmedizinischen Diagnostik

„Vor die Therapie haben die Götter die Diagnose gesetzt“. Dieser Ausspruch wird dem berühmten Internisten Prof. Dr. Franz Vollhardt zugeschrieben, der Anfang des 20. Jahrhunderts die deutsche Medizin an verschiedenen Standorten seines Wirkens nachhaltig geprägt hat, unter anderem auch um 1910 als ärztlicher Direktor am Klinikum Mannheim, dem damals größten Krankenhaus im südwestdeutschen Raum. Vollhardt war überzeugt, dass es eines medizinisch-diagnostischen Laborfachs bedürfe, welches krankheitsbedingte Veränderungen der physiologischen Chemie studieren und die daraus gewonnenen pathobiochemischen Erkenntnisse für eine bessere medizinische Diagnostik der behandelnden Medizin verfügbar machen sollte. Auch wenn wir uns in der Medizin seither um „gefühlte Äonen“ weiterentwickelt haben, hat sich an der Richtigkeit von Vollhardt’s Position bis heute nichts geändert. Tatsächlich ist das Gegenteil der Fall.

Gestützt auf ihre umfassende analytische Expertise hat es die Laboratoriumsmedizin immer verstanden, technologische Quantensprünge zur Erweiterung ihres Spektrum an diagnostisch wertvollen Biomarkern zu etablieren und zu nutzen; dies völlig unabhängig davon, ob zur Beantwortung medizinischer Fragen die Untersuchung von Spurenelementen, kleinmolekularen Substanzen und Metaboliten, Proteinen und Proteinfunktionen, genetischen Information oder auch von Zellen notwendig sind. Dass heute rund 70% aller medizinischen Entscheidungen direkt oder indirekt von Laborergebnissen abhängen bzw. von ihnen beeinflusst werden, liegt einerseits an einer ständig wachsenden Zahl diagnostisch relevanter Biomarker und andererseits an der medizinischen Expertise der Labormedizin im Umgang mit der damit einhergehenden zunehmenden Komplexität der Ergebnisse. Nicht erst seit „Dr. House“ ist schließlich bekannt, wie wichtig neben dem korrekten Messresultat das Aufspüren und Interpretieren vielschichtiger Muster aus quantitativen und qualitativen Befunden ist, damit jeder Patient in seinen komplexen Krankheitszusammenhängen den optimalen und sicheren Nutzen aus der labormedizinischen Diagnostik erhalten wird.

Die Entdeckung, dass zellfreie DNA (cfDNA)sowohl beim gesunden als auch kranken Menschen im Blut zirkuliert und aus einer einfachen Blutprobe isoliert und analysiert werden kann, ist nicht neu [1], [2], [3], [4]. cfDNA ist im Plasma ausreichend lange stabil, um sie molekulargenetisch untersuchen zu können. Zusammen mit der Einführung der digital droplet PCR (ddPCR), einer Kombination von digitaler PCR [5] und Emulsions-PCR [6] ist nicht mehr nur die empfindliche und quantitative Detektion, sondern auch die Sequenzaufklärung der zirkulierenden DNA-Fragmente in Blut oder anderen Körperflüssigkeiten möglich.

Das Spektrum krankheits-assoziierter, sowohl qualitativer als auch quantitativer Veränderungen der cfDNA und die sich hieraus ergebenden Möglichkeiten elektrisieren seit kurzem die medizinische Diagnostik. Erste wesentliche Impulse zur Analytik zirkulierender Nukleinsäuren wurden von Dennis Y.M. Lo auf dem Gebiet der nicht-invasiven pränataler Testung (NIPT) gegeben, der schon 1999 erste Arbeiten zur pränatalen Untersuchung zirkulierender fetaler DNA im mütterlichen Plasma vorstellte [7], [8], [9]. In 2010 konnte er zeigen, dass sich das gesamte fetale Genom aus seiner im mütterlichen Plasma zirkulierenden DNA sequenzieren ließ [10] und in 2011 stellte seine Gruppe eine nicht-invasive pränatale Diagnostik der fetalen Hämophilie bei heterozygoten Schwangeren vor [11].

Wir wissen heute, dass zirkulierende Nukleinsäuren nicht als „nackte DNA“ im Plasma zirkulieren, sondern an Nukleosomen gebunden und in Zellmembranpartikeln (Mikropartikel, Mikrovesikel, Exosomen) „verpackt“ sind. Dies Partikel transportieren neben Nukleinsäuren (DNA, RNA, miRNA) auch Proteine und sind ein Werkzeug interzellulärer Kommunikation [12]. Während nackte DNA aufgrund ihrer ausgesprochen anionischen Ladung die Zellmembran nicht überwinden kann, ist dies für verpackte DNA möglich. In experimentellen Studien wurde für cfDNA in synthetisierten Nukleosomen eine hocheffiziente Transfektionsrate bis zu 35% sowie ein nukleärer Transport gezeigt. Auch der Verbleib im Zellkern konnte dokumentiert werden [13], [14]. Es ist derzeit aber noch unklar, ob transferierte cfDNA genomisch integriert wird und in nachfolgenden Zellteilungen nachweisbar bleibt. Hierzu müsste es gelingen, Integrationssequenzen in den Empfängergenomen zu identifizieren und damit ggfs. Aussagen über spezifische und Krankheits-assoziierte Integrationsorte zu ermöglichen. Unabhängig davon existiert zunehmend eine direkte Evidenz, dass cfDNA-Fragmente als mobile genetische Elemente fungieren können. Die biologische Rolle der cfDNA ist derzeit nicht in allen Fällen von Krankheitsbeobachtungen klar.

cfDNA wird während Apoptose und Nekrose aus untergehenden Zellen frei. Umgekehrt wirkt aufgenommene cfDNA wahrscheinlich über DNA-Damage-Pathways als starkes Apoptosesignal in den aufnehmenden Zellen [15].

Erhöhte Konzentrationen von cfDNA korrelieren mit klinischen Scores bei Intensivpatienten mit schweren Infektionen und Organdysfunktion und eignen sich wahrscheinlich als Prädiktor für die Mortalität bei Schwerstkranken. Dies ist vereinbar mit der bekannten Tatsache, dass im Rahmen schwerer Infektionen verstärkte Apoptose bei zirkulierenden Blutzellen festgestellt werden kann [16], [17], [18]. Bei schwerkranken Patienten ist auch eine unmittelbare funktionelle Verbindung zwischen erhöhten Konzentrationen von cfDNA, ihrer prokoagulatorischen Interaktion mit DNA-bindenden Proteine im Blut und dem Auftreten hämostaseologischer Komplikationen inklusive DIC beschrieben [19]. Auch bei Myokardinfarkt und Stroke wurde cfDNA als prognostischer Marker identifiziert und korrelierte in der Höhe mit der Auslenkung klinisch-chemischer Parameter [20], [21], [22]. Im Rahmen der Transplantationsmedizin lassen sich zirkulierende Donor-DNA-Fragmente im Blut von Transplantationspatienten nachweisen [23]. Konzentrationen und Qualität der cfDNA ändern sich möglicherweise systematisch im Rahmen des Alterns, und cfDNA könnte hierbei eine ständige Quelle für Mutagenese, Mosaicismus und genomische Instabilität und damit eine Ursache alterassoziierter genomischer Intabilität und Seneszenz sein [24], [25].

Wenn cfDNA-Fragmente als mobile genetische Elemente betrachtet werden können, die von Zelle zu Zelle weitergegeben werden und das Zellverhalten beeinflussen, eröffnet dies eine völlig neue Perspektive auf die Zellbiologie sowie natürlich auch die Pathobiochemie von Krankheitsentstehung und -verlauf. In Zusammenhang mit Tumorerkrankungen gibt es zunehmend Hinweise, dass Zellen DNA-/RNA-enthaltende Exosomen aktiv ausschleusen können.

In experimentellen Systemen wurde gezeigt, dass Fibroblasten, deren BRCA-basiertes Tumorsuppressorfunktion durch Gene editing ausgeknockt (KO) worden war, eine stärkere Aufnahme von Exosomen zeigen und nach Kontakt mit Serum von Tumorpatienten einen malignen Phänotyp entwickelten, der bei Wildtypzellen nicht auftrat. Bei Kontakt der KO-Zellen mit dem Serum Gesunder blieb die Transformation aus [26]. Dies unterstützt Hypothesen, wonach zirkulierende, aus dem Tumor stammende DNA (ctDNA), eine wichtige Rolle in der Vorbereitung der Metastasierung haben könnte [12], [27].

Gerade in der Onkologie nutzt die heutige Medizin zunehmend präzise pathobiochemische Kenntnisse über Krankheitsursachen und –mechanismen für eine detailliertere Diagnostik und das Design neuer und verfeinert zielgerichteter Therapien. Seit der Einführung des Imatinib zur Behandlung der chronisch myeloischen Leukämie hat sich in der Krebsmedizin ein Paradigmenwandel vollzogen, der inzwischen auch in der Onkologie der soliden Tumoren angekommen, deren molekulares Profil notorisch heterogen ist. Ihre Zellen sind einem ständigen Selektionsdruck unterworfen, der zu bisher nur in Ansätzen verstandenen, aber für die Tumorbiologie kritischen molekulargenetischen und epigenetischen Veränderungen führt [28], [29]. Entsprechend weichen traditionelle Einteilungen auf der Basis histopathologischer Klassifikationen zunehmend funktionell relevanten molekulargenetischen Klassifikationen. Nur das molekulare Make-Up des Tumors erlaubt einen Zugang zu einer rationalen Pathway-gesteuerten Therapie, deren Festlegung bisher auf den Ergebnissen der molekularen Analyse aus dem Tumorgewebe erfolgt.

Die Rolle der frei zirkulierenden Tumor-DNA (ctDNA) für die Diagnostik von Tumorerkrankungen ist aus den Entwicklungen anderer Bereiche der diagnostischen Medizin absehbar.

Zunächst konnten Leary et al. [30] in einer wegweisenden Arbeit zeigen, dass sich die in soliden Tumoren stets vorkommenden chromosomalen Störungen und Translokationen zunächst durch massive parallele DNA-Sequenzierung des Tumorgewebes als individuelle Biomarker identifizieren lassen. Die identifizierten chromosomalen Bruchpunkte wurden anschließend für Verlaufsuntersuchungen der ctDNA bei den jeweiligen Patienten eingesetzt (personalized analysis of rearranged ends, PARE). Seither hat eine Vielzahl von Untersuchungen ergeben, dass ein liquid Profiling der „molekularen Defektsignatur“ des Tumors im Blut eine neue diagnostische Möglichkeit darstellt, deren hohes Potenzial sich bisher noch nicht umfassend abschätzen lässt [31], [32], [33]. Dass ctDNA ein generell auftretendes Phänomen des Tumors ist, wurde bisher am umfänglichsten durch Bettegowda et al. an 640 Patienten mit den unterschiedlichsten Tumorerkrankungen gezeigt. Die diagnostische Sensitivität hing in dieser Studie nicht überraschend vom Tumortyp, dessen Organlokalisation sowie auch vom Tumorstadium ab [34].

Empfindliche und qualitativ hochwertige Methoden zeigen, dass cfDNA bei Tumorpatienten zu einem gegenüber anderen Diagnostikmodalitäten früheren Nachweis von Rezidiven und Entwicklungen von Therapieresistenz führt [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51]. Die Analyse der ctDNA besitzt damit ein wichtiges Potenzial für die frühere Identifikation von Therapieversagern, wie sie zum Beispiel während der Therapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit anti-EGFR Antikörpern auftreten. In diesen Fällen werden im Verlauf in der ctDNA kras-Mutationen nachweisbar, die im Primärtumor zunächst nicht nachgewiesen wurden [29]. Das sekundäre Auftreten dieser Mutationen ist eher Ausdruck einer durch die molekularpathologische Primärdiagnostik nicht erfassten Minoritätsfraktion von Tumorzellen, als dass diese unter dem Selektionsdruck der Therapie während des Progresses neu entstanden sind.

In der einschlägigen Literatur ist die Untersuchung zirkulierender Tumor-DNA mit dem wenig geeigneten Begriff „Liquid Biopsy“ belegt. Während eine Biopsie dem Pathologen wichtige Aufschlüsse über komplexe Gewebezusammenhänge wie z.B. Tumornekrose, Hypoxiezeichen, Vaskularisierung und Gefäßstatus des Tumorbetts, Stromareaktion des Normalgewebes, Infiltration des Tumors durch Zellen des innaten und kognaten Immunsystems sowie schließlich wichtige phänotypische Differenzierungsmerkmale der Tumorzellen und ihrer morphologischen Heterogenität gibt, erlaubt die sog. „Liquid Biopsy“ nichts dergleichen. Sie entstammt weder einem bioptisch entnommenem Gewebe noch besitzt sie die komplexen Merkmale einer Gewebeprobe, sondern stellt eine Nukleinsäureextraktion mit anschließender Amplifikation aus Körperflüssigkeiten dar. Entsprechend ermöglicht sie ausschließlich die Identifikation verschiedener molekularer Eigenschaften des Tumors ohne jeden Gewebezusammenhang, am ehesten im Sinne eines „Liquid Profiling“ d.h. der Erfassung eines Krankheits-definierenden Markerprofils, wie sie in der Labormedizin üblich ist.

Es ist zu erwarten, dass sich die Methoden des ctDNA-Profilings in den kommenden Jahren weiter verfeinern und schließlich die komplette molekulare Tumordiagnostik aus dem Blut ermöglichen werden. Dies wurde tatsächlich schon 2006 durch Jeff Ross und Maureen Cronin in ihrer Betrachtung der Entwicklung der molekular-onkologischen Diagnostik vorhergesagt [52]. Diese Entwicklung wird auch bei Newman und Mitarbeiter erwartet. Die Autoren haben 2014 eine Methode (CAPP-Seq; Cancer-Personalized-Profiling by Deep Sequencing) vorgestellt, die eine empfindliche Analyse von ctDNA ermöglicht [53]. Ähnlich wie bei Leary et al. [30] steht am Anfang des CAPP-Seq-Verfahrens die molekularpathologische Gewebeanalyse. In einer Weiterentwicklung haben Newman et al. [54] eine Modifikation mit „integrated Digital Error Suppression“ (iDES) vorgestellt, welche eine rund 30-fach verbesserte Sensitivität erlaubt und damit an die digital droplet PCR heranrückt. In ihrem aktualisierten Workflow gehen Newman und Kollegen zukünftig von einer primären Tumordiagnostik durch „liquid Profiling im Blut“ aus.

Die Durchführung der hochsensitiven Verfahren in der cfDNA-Diagnostik erfordert eine hohe methodische Expertise, Erfahrung bei der Strukturierung und in der Durchführung durchgreifender Qualitätssicherungsverfahren sowie schließlich eine Infrastruktur, die den zu erwartenden Aufgaben des molekulargenetischen Tumorprofilings in der Versorgung gewachsen ist. Hierfür sind geeignete Verfahren zu entwickeln und einzusetzen [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Diese Voraussetzungen sind für den Therapeuten und seine Patientinnen und Patienten unerlässlich, um die hochwertige diagnostische Versorgung effizient zu sichern. Diese Einschätzung werden durch kritische Untersuchungen zur Richtigkeit der NIPT gestützt, welche die Bedeutung der Qualitätssicherung bei bis zu 26% falsch negativen Ergebnisse in der pränatalen Diagnostik fetaler DNA im Blut eindrucksvoll belegen [62].

Zusammenfassend lässt sich festhalten:

Nicht-invasive Detektion zirkulierender Nukleinsäuren hat ein hohes Potenzial, nicht nur die medizinische Labordiagnostik in der Zukunft für viele klinische Fragestellungen zu verändern, sondern auch grundlegende wissenschaftliche Fragen zu bearbeiten. Dies liegt zum einen in der interessanten Biologie der cfDNA, den wachsenden technischen Möglichkeiten eines immer empfindlicheren Nachweises sowie an der hohen Spezifität molekulargenetischer Marker.

So konnte die Klinische Chemie in der Onkologie mit den klassischen Tumormarkern bisher hauptsächlich eine quantitative Bestimmung von Surrogatmarkern für die Verlaufs- und Prognoseabschätzung zur Verfügung stellen. Demgegenüber erlaubt die Untersuchung der cfDNA nun die Identifikation molekulargenetischer Defekte, welche für die Pathobiochemie des Tumorstoffwechsels kausal und das maligne Wachstum bedeutsam sind, mit einer bisher nicht verfügbaren Sensitivität und Spezifität. Wo für molekulare Defekte entsprechende zielgerichtete Therapieansätze verfügbar werden (und diese Zahl wird sich absehbar weiter erhöhen), wird sich die Labordiagnostik zu einer „Companion-Diagnostik“ wandeln, die für den Therapeuten auch in Zusammenhang mit anderen etablierten Laborparametern eine entscheidende „actionable health information“ darstellt. Entsprechend wird in Zukunft die Nukleinsäure-basierte Diagnostik aus dem Plasma als ein wichtiger diagnostischer Baustein rasch an Bedeutung gewinnen.